5 фактов которые вы не знали о глутатионе
Глутатион – наиболее сильный антиоксидант, который может производить организм человека.
Глутатион – это скорая помощь для клетки: он всегда готов к нейтрализации агрессивных продуктов и восстановлению.
Как принимать глутатион
Если вы хотите улучшить свое здоровье, то нецелесообразно принимать глутатион в таблетках: он не очень эффективно проникает в кровь из желудочно-кишечного тракта. Более надежный способ повысить концентрацию этого антиоксиданта – принимать компоненты, из которых он синтезируется. Глицин, цистин, глутаминовая кислота – принимайте эти «кирпичики» в виде препарата, и уже внутри клетки они смогут превратиться в глутатион.
Это происходит ежедневно. Каждый день в организме человека образуются опасные агенты, которые способны привести к развитию онкологического процесса. Глутатион способствует их обезвреживанию в тот момент, когда они только появились, и не дает развиться патологическим изменениям.
Помогает ли глутатион победить рак уже тогда, когда опухоль существует? Скорее всего, нет. Протоколы лечения рака очень строги, и любое вмешательство в процесс может привести к стимулированию роста опухоли или замедлению процесса лечения. Особенно осторожно следует относиться к препаратам, которые прямо влияют на метаболизм.
Глутатион вырабатывается в каждой клетке, но показатель благополучия, как показали доклинические исследования, – активность его в печени. По количеству фермента, который превращает аминокислоты в глутатион, можно сделать вывод о жизнеспособности еще не родившихся мышат. Те из них, кто имел мутацию и низкую активность глутатиона в печени, умирали в течение месяца после рождения от печеночной недостаточности.
Маркер продолжительности жизни
Чтобы узнать, сколько еще ресурсов осталось у вашего организма, достаточно определить количество глутатиона в организме. Ученые утверждают, что снижение объема в организме глутатиона на 30% приводит к серьезным нарушениям в клетках. После 20 лет его количество уменьшается в среднем на 1% каждый год. Это естественный процесс замедления метаболизма. Но если вы живете в неблагоприятных условиях, ведете нездоровый образ жизни, то количество глутатиона будет снижаться еще быстрее. Чтобы компенсировать этот процесс, необходимо принимать аминокислоты, из которых синтезируется глутатион: глицин, цистин, глутаминовую кислоту.
Глутатион помогает продлить активный период жизни, но и физические нагрузки, в свою очередь, стимулируют выработку глутатиона в организме. Врачами рекомендуются умеренные физические нагрузки: они запускают процессы регенерации, не создавая ненужного стресса. Как понять какая нагрузка умеренная? Та, с которой вы справляетесь, чувствуя легкую усталость. Если вы не уверены в состоянии вашего здоровья, то перед началом тренировок проконсультируйтесь с врачом.
Глутатион продается отдельно, но только в виде пищевой добавки. При этом есть и другой способ увеличить его концентрацию в клетках. Лекарственный препарат Элтацин содержит три аминокислоты – глицин, глутаминовую кислоту и цистин – которые являются метаболическими предшественниками глутатиона. Попадая в организм, они помогают ему вырабатывать в тканях свой собственный глутатион – там, где нужно и в необходимых количествах.
Японские ученые изобрели лекарство для остановки старения
Японские ученые открыли механизм, который помогает избавиться от стареющих клеток организма. Об этом 18 февраля рассказал профессор НИИ медицины Токийского университета Макото Наканиси.
В основе технологии — избавление от стареющих клеток организма, которые уже не могут делиться, но при этом способны вызывать воспаления и старение.
«То есть если удалить эти клетки, можно будет остановить спровоцированные ими воспалительные процессы, а следовательно — добиться существенного улучшения симптомов старения», — цитирует «РИА Новости» Накасини.
Ученые выяснили, что стареющие клетки нуждаются в ферменте GLS1, который помогает им выживать. С помощью ингибитора фермента, который будет его тормозить, удастся уничтожить клетки, провоцирующие воспаление. В качестве такого ингибитора решили использовать препарат, который уже существует и проходит клинические испытания в качестве лекарства от некоторых видов рака, рост клеток которого тоже зависит от GLS1. Испытания препарата на мышах, по сведениям ученых, прошли удачно.
«Если у него не будет побочных явлений, то его, вероятно, можно будет использовать и против возрастных изменений. То есть вполне возможно, что его широкое применение на самом деле очень близко. Это внушает большую надежду. Хотелось бы, чтобы уже через 5–10 лет его можно было применить для обычных пожилых людей», — добавил специалист.
Осенью 2020 года ученые из Института биологии старения Общества Макса Планка в Германии пришли к выводу, что ограничение количества еды приводит к увеличению продолжительности жизни.
Ингибитор старения
Японские ученые нашли лекарство для остановки старения
Применение лекарства, останавливающего процесс старения и омолаживающего организм, может начаться уже через пять-десять лет: японские ученые открыли механизм, при помощи которого удается избавиться от так называемых «стареющих клеток», и подобрали для этого эффективное лекарство. О результатах экспериментов и перспективах открытия корреспонденту РИА Новости рассказал профессор НИИ медицины Токийского университета Макото Наканиси.
Возрастное ослабление функций организма непосредственно связано с тем, что в органах накапливаются клетки, запускающие системные воспалительные процессы. Одним из видов клеток, которые провоцируют воспаление, являются так называемые стареющие (сенесцентные) клетки. Открытие стареющих клеток или процесса старения клеток было сделано американским ученым Леонардом Хейфликом еще 60 лет назад. Он обнаружил, что клетки могут делиться только определенное количество раз, после чего этот процесс прекращается. Последние же исследования доказали, что процесс деления может прекратиться также и в результате повреждения ДНК, окислительного стресса и других факторов. Стареющие клетки утрачивают способность делиться, накапливаются в организме и вызывают воспаление и старение.
«То есть если удалить эти клетки, можно будет остановить спровоцированные ими воспалительные процессы, а следовательно – добиться существенного улучшения симптомов старения. В 2014 году мы стали изучать, за счет чего такие клетки более не могут размножаться и превращаются в стареющие клетки, и выявили молекулярный механизм. Тогда мы «состарили» клетку – создали клетку с общими для всех стареющих клеток свойствами. И стали искать то, что убивало бы только эти клетки», – рассказал профессор Макото Наканиси.
Ученые выяснили, что для стареющей клетки жизненно важен фермент GLS1. Он тесно связан с процессом метаболизма глутамина. Оказалось, что стареющая клетка нуждается в этом ферменте, чтобы выжить. Это происходит за счет того, что «заводы» по уничтожению ненужных белков – лизосомы в стареющей клетке перестают работать и наполняющая их кислая среда проникает в клетку, создавая угрозу для ее существования. Для того чтобы выжить и нейтрализовать кислую среду, клетка нуждается в аммиаке, который получается при превращении глутамина в глутаминовую кислоту, то есть при процессе, в котором необходим фермент GLS1.
«Не только старые клетки, но и любые другие, где белок не удается разрушить и избавиться от него, становятся клетками, провоцирующими воспаление. И у всех них выживание зависит от GLS1 – фермента, превращающего глутамин в глутаминовую кислоту. Поэтому если использовать его ингибитор (тормозящее вещество), то мы можем уничтожить все клетки, провоцирующие воспаление, включая стареющие клетки. Как мы уже говорили, если с возрастом стареющие клетки, провоцирующие воспалительные процессы, скапливаются в органах, то возникает явление старения. Значит, если эти клетки удалить, то, возможно, процесс улучшится», – рассказал ученый.
В качестве такого ингибитора решили использовать препарат, который уже существует и проходит клинические испытания в качестве лекарства от некоторых видов рака, рост клеток которого тоже зависит от GLS1. Старой мыши ввели этот препарат, тормозящий действие фермента GLS1. В результате чего стали происходить изменения по целому ряду симптомов старческих заболеваний.
У мыши стали лучше функционировать почки: улучшились показатели креатинина сыворотки крови и азота мочевины крови. Изменения произошли также в печени, легких.
«Произошло резкое улучшение в органах и структурах, претерпевших возрастные изменения. После инъекции мы увидели улучшение симптомов диабетической болезни и атеросклероза. Скопление стареющих клеток, провоцирующих воспаление, вызывают и такие возрастные недуги, как болезнь Альцгеймера и Паркинсона. Сейчас мы исследуем, можно ли добиться улучшения и этих заболеваний. Благодаря уничтожению клеток, провоцирующих воспалительные процессы, можно будет облегчить многие возрастные заболевания и связанные с возрастом ослабления функций различных органов. Одним препаратом можно добиться улучшения сразу по многим видам возрастных заболеваний, добиться омоложения. Мы сами очень удивлены и считаем это крайне интересным», – сказал профессор.
Эксперименты на мышах показали не только омоложение внутренних органов, но и укрепление всего организма. Одно из возрастных изменений – ослабление мышечной силы. Если молодая мышь способна удерживаться на жердочке 200 секунд, то старая через 30 секунд падает вниз. Подопытная старая мышь за счет отмирания стареющих клеток стала удерживаться на жердочке в течение 100 секунд.
«Можно сказать, что это омоложение. Во всяком случае мы наблюдаем подобный эффект. Это суть нашего открытия», – подчеркнул профессор Наканиси.
Более того, возможно, практическое применение этого открытия на людях тоже не за горами.
«Самое главное, что это лекарство уже существует и проходит первую фазу клинических испытаний. Если у него не будет побочного действия, то его, вероятно, можно будет использовать и против возрастных изменений. То есть вполне возможно, что его широкое применение на самом деле очень близко. Это внушает большую надежду. Хотелось бы, чтобы уже через пять-десять лет его можно было применить для обычных пожилых людей», – сказал ученый.
Если в ходе этих клинических экспериментов будет доказана безопасность препарата для человека, то станет возможным сначала его применение для людей с прогерией – синдромом преждевременного старения, считает профессор. Далее возможно его использование для тех, кто из-за возрастного ослабления мышц не может вести обычный образ жизни, а также для пациентов, у которых отказали почки и кому необходим диализ.
Профессор Макото Наканиси считает, что если будет доказаны безопасность препарата и его эффективность для воздействия на стареющие клетки у человека, то можно будет добиться увеличения продолжительности жизни и сокращения разрыва между общей продолжительностью жизни и здоровым состоянием человека. Сейчас этот разрыв составляет в среднем около десяти лет.
«Считается, что максимальная продолжительность жизни человека – 120 лет. Один из основных механизмов, почему с возрастом увеличивается процент смертности, заключается в том, что скапливаются клетки, возбуждающие воспалительные процессы. Если удалить этот механизм, то, возможно, процент смертности с возрастом не будет расти. То есть человек сможет дожить здоровым до 100 лет. Он сохранит здоровье и не будет болеть (от старости), но максимальная продолжительность жизни в 120 лет при этом не изменится. Мы считаем, что так произойдет: продолжительность жизни подойдет к 100-120 годам и плюс к этому разница между здоровым состоянием и временем, когда человек умирает, будет сокращено до нуля», – подчеркнул ученый.
Ученые создали лекарство, останавливающее старение человека
Препарат, который омолаживает организм, можно будет использовать уже через пять лет.
Молодильное яблочко, как оказалось, существует не только в сказках, но совсем скоро появится и в жизни. Во всяком случае ученые Научно-исследовательского института медицины Токийского университета нашли механизм, который позволит избавиться от стареющих клеток, тем самым сохранив молодость.
Любой организм с возрастом стареет, независимо от того, какой образ жизни ведет человек. Дело просто во времени: кто-то раньше дряхлеет, кто-то держится подольше молодцом. Как бы то ни было, организм слабеет, так как в нем накапливаются клетки, которые запускают системные воспалительные процессы. Клетки, которые как раз и провоцируют воспаление, так и называют – стареющие (сенесцентные). К слову сказать, открыл эти стареющие клетки еще 60 лет назад американский ученый Леонард Хейфлик. Он доказал, что эти клетки хоть и утрачивают способность делиться, но накапливаются в организме, вызывая воспалительные процессы, что практически изнашивает организм.
Как пояснил профессор НИИ Токийского университета Макото Наканиси, в течение 6 лет его группа изучала причину того, почему эти клетки больше не могут размножаться и превращаются в «стариков».
Тогда-то они и обнаружили, что стареющей клетке важен фермент GLS1 для выживания. Он тесно связан с процессом метаболизма глутамина.
Исследователи пришли к выводу, что если использовать тормозящее вещество (ингибитор), то можно убрать все клетки, которые провоцируют воспалительный процесс в организме, включая и стареющие клетки.
«То есть если удалить эти клетки, можно будет остановить спровоцированные ими воспалительные процессы, а следовательно, добиться существенного улучшения симптомов старения», — уточняет Макото Наканиси.
Профессор вместе со своей командой уверены, что широкое применение препарата очень близко. Наканиси очень надеется, что через 5-10 лет лекарство от старости можно будет применять и пожилым людям.
Стоит отметить, что известный российский биохимик 85-летний Владимир Скулачев уже изобрел лекарство от старости несколько лет назад. Но он тестирует его исключительно на себе и признается, что даже сны видит молодые.
Открытие селективных ингибиторов глутаминазы-2, которые ингибируют mTORC1, активируют аутофагию и ингибируют пролиферацию в раковых клетках
Глутаминаза, которая превращает глутамин в глутамат, участвует в эффекте Варбурга в раковых клетках. Были идентифицированы два гена глутаминазы человека, GLS (GLS1) и GLS2. Из каждого гена глутаминазы возникают два альтернативных транскрипта: во-первых, изоформа почки (KGA) и глутаминаза C (GAC) для GLS; и, во-вторых, изоформа печени (LGA) и глутаминаза B (GAB) для GLS2. Хотя GLS1 считается терапевтической мишенью для рака, потенциальная роль GLS2 в раке остается неясной. Здесь мы обнаружили ряд алкилбензохинонов, которые преимущественно ингибируют изоформа глутаминазы В (GAB, GLS2), а не изоформ почки глутаминазы (KGA, GLS1). Мы идентифицировали аминокислотные остатки в аллостерическом кармане связывания, ответственном за селективность. Обработка алкилбензохинонами снижала активность внутриклеточной глутаминазы и уровень глутамата. GLS2 ингибированием алкилбензохинонами или GLS2 siRNA снижала пролиферацию клеток карциномы и независимое от фиксации образование колоний и индуцированную аутофагию через AMPK-опосредованное ингибирование mTORC1. Наши результаты демонстрируют аминокислотные последовательности для селективного ингибирования изоферментов глутаминазы и подтверждают GLS2 как потенциальную противораковую мишень.
Раковые клетки, как правило, проявляют эффект Варбурга, в котором клеточный метаболизм протекает через: 1) измененный метаболизм глюкозы, характеризующийся высокой скоростью гликолиза с последующим ферментацией молочной кислоты; и 2) повышенный уровень глютаминолиза путем увеличения активности глютаминазы. Глютамин необходим для пролиферации раковых клеток, особенно в контексте анаплероза цикла трикарбоновой кислоты (TCA). Глутаминаза играет важную роль в превращении глутамина в глутамат, который превращается глутаматной дегидрогеназой в α-кетоглутарат. Этот α-кетоглутарат входит в цикл TCA, где он участвует в производстве АТФ, нуклеотидов, некоторых аминокислот, липидов и глутатиона в митохондриях [1]. Недавно глутаминаза стала лекарственной мишенью для развития ингибиторов глутаминазы для лечения злокачественных заболеваний [2]. Однако были идентифицированы только несколько серий ингибиторов глутаминазы для GLS1, и была продемонстрирована только частичная in vivo противораковая эффективность 4.
Существует два гена глутаминазы человека, GLS (GLS1) и GLS2, расположенные в хромосомах 2 и 12 соответственно. Из каждого гена глутаминазы возникают два альтернативных транскрипта: изоформа почки (KGA) и глутаминаза C (GAC) для GLS1; и изоформы печени (LGA) и глутаминазы B (GAB) для GLS2 [7].
Переход димер-тетрамер необходим для ферментативной активации глутаминазы, которая активна в качестве тетрамера. Фосфат усиливает эту активацию, облегчая переход димера-тетрамера и вход субстрата в карманы связывания, конкурируя с глутаматом продукта [3, 8]. Каждая изоформа глутаминазы имеет различные кинетические и молекулярные характеристики, а активность каждого из них также модулируется различными соединениями, такими как глутамат, цитрат, кальций, некоторые жирные кислоты с длинной цепью, жирные ацил-CoA-производные, промежуточные продукты цикла TCA и протоны [9], все из которых присутствуют в физиологических условиях. Поэтому кинетические и аллостерические свойства фермента и физиологической среды необходимы для регулирования активности фермента in situ. Кроме того, дифференцированные аминокислотные остатки или домены изоцианов глутаминазы обеспечивают потенциальные связывающие карманы для селективных аллостерических модуляторов. Например, BPTES (бис-2- (5-фенилацетимидо-1,2,4-тиадиазол-2-ил) этилсульфид), селективный ингибитор GLS1, связывает GAC через дифференцированную стробирующую петлю, близкую к сайту связывания субстрата глутамина, и блокирует тетрамер GAC в непроизводительную конформацию [3].
В отличие от показаний к применению ингибиторов KGA и GAC (GLS1), описанных для борьбы с раком [5, 6, 10], биологическая роль GLS2 все еще находится в стадии исследования. Было обнаружено, что GLS2 регулирует энергетический обмен и антиоксидантную функцию в качестве гена супрессора опухоли 13 при эктопически сверхэкспрессированном [11]; обогащение LGA ингибирует рост клеток глиомы и облегчает химиотерапевтическое вмешательство [14]. Однако срыв экспрессии GLS2 сенсибилизирует рак шейки матки к ионизирующей радиации и, таким образом, уменьшает размер опухоли за счет уменьшения клеточного глутатиона и NADH [15]. Поэтому требуется больше работы, чтобы прояснить и продемонстрировать роль GLS2 в росте раковых клеток.
Подавление глутаминазы блокирует превращение глутамина в глутамат и, таким образом, отключает превращение глутамата в α-кетоглутарат глутаматдегидрогеназой, которая обычно входит в цикл TCA для обеспечения энергии и биопрекурсоров для роста раковых клеток. Аутофагия — это катаболический процесс, обычно активируемый такими условиями лишения питательных веществ, и приводит к аутофагосомно-лизосомальной деградации объемного цитоплазматического содержимого. Аутофагия инициируется и продвигается по оси AMPK_ULK1, но ингибируется mTORC1 [16]. AMPK ощущает изменения энергии в клетках и активируется, когда питательные вещества истощаются [17]. Рапамицин ингибирует эффект Варбурга [18, 19], а глютаминолиз подает mTORC1 [20], так что существует комплексная обратная связь между mTOR и глутаминазой и эффектом Варбурга. mTORC1 также является критическим регулятором индукции аутофагии и активации mTORC1 подавляет аутофагию. AMPK взаимодействует с фосфорилатами и активирует протеинкиназу ULK1, ключевой инициатор аутофагического процесса. Residue Ser317 ULK1 является основным сайтом фосфорилирования для активации AMPK [16]. У млекопитающих AMPK регулирует аутофагию, также включает инактивацию пути mTORC1 при дефиците питательных веществ через два различных пути: фосфорилирование для активации обменного фактора Туберина или Raptor [21]. Напротив, mTOR фосфорилирует ULK1 на Ser757 и нарушает взаимодействие между ULK1 и AMPK для ингибирования аутофагии [16]. Кроме того, сеть Beclin1 также может индуцировать и регулировать аутофагию посредством образования базовых комплексов Beclin1-Vps34-Vps15 и зарождения фагофоров. Взаимодействие BCL2 с Beclin1 уменьшает аутофагию. Фосфорилирование BCL2 с помощью c-Jun N-концевой киназы 1 (JNK1) высвобождает Beclin1, позволяя ему войти в процесс зарождения аутофагии [22]. Фосфорилирование Beclin1 ULK1 на Ser15 (Ser14 у мышей) также требуется для полной аутофагической индукции у млекопитающих [23].
Природные продукты являются основным источником вдохновения при обнаружении лекарств [24, 25] и представляют собой хороший ресурс для тех, кто ищет новые ингибиторы глутаминазы. В то время как GLS1 становится терапевтической мишенью для противоопухолевых препаратов [5, 6, 10], биологическая роль GLS2 все еще находится в стадии исследования. Здесь мы раскрываем серию природных алкилбензохинонов с ингибирующим глутаминазой эффектом. Через гомологичное моделирование и мутагенез сайт алкилбензохинонового связывания моделировали и демонстрировали, что он является аллостерическим карманом. Было обнаружено, что из аллостерического кармана было обнаружено два диверсифицированных дифференцированных остатка для избирательного ингибирования GAB (изоформы GLS2) над KGA (изоформа GLS1). Кроме того, ингибирование активности глутаминазы активным алкилбензохиноном AV-1 в клетках карциномы приводило к аутофагии через AMPK-опосредованную активацию ULK1 и ингибирование mTORC1, что в конечном итоге приводило к ингибированию роста раковых клеток.
Для скрининга против KGA была представлена коллекция из 200 натуральных продуктов, выделенных из множества местных тайваньских растений. Человеческие рекомбинантные KGA и GAB (фиг. 1A) из E. coli клонировали, экспрессировали и очищали. Характеристика его ферментативных свойств показала, что рекомбинантный GAB, но не KGA, реагировал на его субстрат глутамина в аллостерических и позитивных кооперативных манерах (фиг. 1B и 1C), как ранее сообщалось для этих ферментов, очищенных от биопсий человека [26]. Сначала мы провели скрининг объединенной коллекции, описанной выше для ингибирующей активности против рекомбинантного KGA, а затем определили значения IC50 против KGA и GAB для сильных соединений (таблица 1, рис. 1D).
Среди активных соединений химии ряд алкилбензохинонов из Ардизии. Было обнаружено, что virens (таблица 1, серия AV) проявляют ингибирование человеческого KGA и GAB (таблица 1 и рисунок 1D). Было обнаружено, что кето (гидроксильные) группы в положениях 1 и 4 на сердцевине бензохинона и ацетатной группе в положении 2 ‘являются существенными для потенции для ингибирования KGA или GAB путем сравнения наиболее сильных соединений AV-1, AV- 2 и AV-8 (значения KGA, IC50 2,1 ± 0,1 мкМ, 3,9 ± 0,4 мкМ, 2,9 ± 0,1 мкМ, GAB, значения IC50 0,28 ± 0,02 мкМ, 0,29 ± 0,05 мкМ, 0,26 ± 0,05 мкМ соответственно) на другой AV (значения KGA, IC50> 40 мкМ, GAB, значения IC50> 4,7 мкМ) (таблица 1).
См. Материалы и методы для измерения значений IC50. Показанными структурами являются алкилбензохиноны и алкилфенолы, выделенные из растений Ardisia virens (серия AV) и A. kusukuensis (серия AK) [27, 28]
Было обнаружено, что, как было установлено, что AV-соединения являются селективными для GAB над KGA, был изучен режим ингибирования AV-1 (наиболее активный). AV-1 ингибировал как KGA, так и GAB в смешанном неконкурентном ингибировании; когда концентрация AV-1 была увеличена с 0 до 30 мкМ, значения Km увеличились на 2,9 и 1,6 раза, а значения Vmax снизились до 61% и 54% для KGA и GAB соответственно (рис. 1 B и 1C). AV-1 показал значения Ki 1,20 ± 0,06 мкМ для KGA и 0,14 ± 0,01 мкМ для GAB, рассчитанные с использованием уравнения Ченга-Прусова; AV-1 оказывал положительное совместное действие с глутамином субстрата при ингибировании GAB с коэффициентом Хилла
1,3-1,4 и независимым способом ингибирования KGA с коэффициентом Хилла
1,0-1,2 (фиг. 1B и 1C). В заключение, механизмы, с помощью которых AV-1 ингибирует GAB и KGA, различны.
(A) Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS, несущий pET28a (+) — KGA или pET28a (+) — GAB размножали в среде бульона Лурия-Бертани в присутствии канамицина, из которого экспрессия белка KGA или GAB индуцировалась 0,5 мМ IPTG. Полученный клеточный лизат обрабатывали ультразвуком и центрифугировали на фракции клеточного осадка (дорожка 1) и супернатант (дорожка 2). Супернатант пропускали через аффинную колонку (HisTrapTM HP), а проток был показан на дорожке 3, а также промывали 100 мМ и 150 мМ имидазола для KGA (левая панель) или 50 мМ имидазола для GAB ( правая панель) показаны на дорожке 4. Показанная полоса 5 была элюентом с 500 мМ имидазола для KGA (левая панель) или 200 мМ имидазола для GAB (правая панель). Молекулярные маркеры обозначали как кДа. (B) Режим ингибирования активного алкилбензохинона AV-1 для KGA в отсутствие фосфата. (C) Режим ингибирования активного алкилбензохинона AV-1 для GAB в отсутствие фосфата. Для расчета значений Ki AV-1 для KGA = 1,20 ± 0,06 мкМ и GAB = 0,14 ± 0,01 мкМ использовали уравнение Чэн-Прусова Ki = IC50 / (1+ [S] / Km). (D) Зависимое от дозы ингибирование алкилбензохинонов против очищенного рекомбинантного KGA и GAB в отсутствие фосфата.
Основываясь на рассмотренных выше структурах структуры активности и режимах ингибирования, мы попытались определить возможное расположение сайта AV-1-связывания на GAB [3]. Гомологическое моделирование для GAB проводилось с использованием кристаллической структуры GUS1 человека 3UO9 и AutoDock Vina (http://vina.scripps.edu/). AutoDock Vina также использовалась для проведения исследования стыковки для соединения AV-1 по всей поверхности гомологичного смоделированного димера или мономера ГАБ. Моделируемый карман для связывания AV-1 со стыковки показал большую связь между водородом и ван-дер-ваальсовым взаимодействием между AV-1 с остатками GAB H408, Q452, K453, S456, H461 и H472 (рисунок 2A). Связующий карман расположен на С-концевом конце мономера ГАБ, рядом с интерфейсом взаимодействия димера. Однако для АВ-1 не обнаружено межмономерных взаимодействий, и поэтому предполагается, что один АВ-1 связывается с одним GAB-мономером, как показано на фиг.2В. Дальнейшее сравнение последовательностей KGA и GAB в области связывания AV-1 указывает на то, что остатки GAB Q452 и K453 были отличены от соответствующих остатков KGA H519 и D520 (фиг. 2C).
Затем были проведены исследования мутагенеза для подтверждения взаимодействия для селективности. Когда остатки Q452 и K453 в GAB мутировали в His или Asp для получения мутантов Q452H, K453D или Q452H / K453D, тормозящий эффект значительно снижался: значения IC50 0,28 ± 0,02 мкМ (дикий тип), 1,33 ± 0,32 мкМ (Q452H ), 4,17 ± 0,11 мкМ (K453D) и 5,51 ± 0,28 мкМ (Q452H / K453D). Эти результаты показывают, что эффекты двух точечных мутаций GAB при уменьшении активности AV-1 были аддитивными. Напротив, когда соответствующие остатки H519 и D520 в KGA мутировали в Gln или Lys с получением мутантов H519Q, D520K или H519Q / D520K, тормозящий эффект увеличивался: значения IC50 2,1 ± 0,1 мкМ (дикий тип), 1,67 ± 0,12 мкМ (H519Q), 0,29 ± 0,03 мкМ (D520K) и 0,23 ± 0,03 мкМ (H519Q / D520K). Эти результаты показывают, что эффекты двух точечных мутаций KGA обратно увеличивают эффективность AV-1.
Более того, AV-1 сравнительно ингибировал дикий тип и два KGA-мутанта, соответствующие GAC (F318Y / F322S, Y394L) (рис. 2D), в то время как эти два мутантных фермента KGA были устойчивы к ингибированию BPTES из-за потери ключевых взаимодействий, ранее сообщавшиеся данные о сокристаллизации (рис. 2D) [3]. Поэтому мы заключаем, что взаимодействия между остатками AV-1 и GAB Q452 и K453 определяют селективность для GAB над KGA.
(A) Моделирование стыковки сайта связывания AV-1 в GAB. Маджента: H408 гистидин; Желтый: глутамин Q452; Оранжевый: лизин K453; Красный: S456 серин; Cyan: H461 гистидин; Синий: лизин K472; Пунктирные линии: взаимодействия водородной связи. Была показана химическая структура AV-1 с взаимодействующими остатками ГАБ. (B) Обзор предлагаемой ассоциации AV-1 в тетрамере GAB. Левая панель представляет вид сверху и правую панель сбоку. AV-1 представлен в красной и зеленой фигуре для ясности, а молекулы глутамата показаны как оранжевые сферы. (C) Первичная последовательность выравнивания человеческого KGA и человеческого GAB вокруг имитируемого сайта связывания AV-1. Ключевые интерактивные выходы обозначаются стрелками. Мутационные сайты для селективности GAB над KGA обозначаются красными стрелками. (D) значения IC50 и индекс селективности AV-1 & BPTES для GAB или KGA дикого типа и мутантных ферментов. Мутации в остатках Q452 и K453 GAB в соответствующие остатки KGA создали GAB-мутанты GAB_Q452H, GAB_K453D и GAB_Q452H / K453D. Мутации в остатках H519 и D520 KGA в соответствующие остатки GAB создали KGA-мутанты KGA_H519Q, KGA_D520K и KGA_ H519Q / D520K. Мутации у остатков F318 / F322 и Y394 KGA в соответствующие остатки GAB или бактериальной глутаминазы создали KGA-мутанты KGA_F318Y / F322S и KGA_Y394L [3].
45-81% (рисунок 3D), и образование колоний было ингибировано соответственно (рис. 3C, правая панель). Обработка AV-1 значительно уменьшала активность внутриклеточной глутаминазы и уровень глутамата продукта (рисунок 3E и 3F). Таким образом, алкилбензохиноны ингибируют рост клеток карциномы, ингибируя активность клеточной глутаминазы.
