Определение белка в молоке: секреты формольного титрования
Широко распространенным методом определения массовой доли белка в молоке является формольное титрование. Метод имеет ограничения и может применяться только для сырого (непастеризованного) молока кислотностью не выше 20 °Т [1]. Однако зачастую на предприятиях молочной промышленности его используют для контроля массовой доли белка в нормализованной смеси после пастеризации и даже в готовом питьевом молоке, прошедшем различную тепловую обработку (пастеризацию или стерилизацию). Чтобы понять, почему нельзя этого делать, рассмотрим химизм метода формольного титрования.
Это титриметрический метод, основанный на нейтрализации карбоксильных групп моноаминодикарбоновых белков раствором гидроксида натрия. Количество щелочи, затраченное на нейтрализацию, пропорционально массовой доле белка в молоке.
Как известно, для молекул белка характерно присутствие положительно заряженных аминогрупп (–NH3 + ) и отрицательно заряженных карбоксильных групп (–СОО ¯ ). Находясь в одной молекуле, разноименно заряженные амино- и карбоксильные группы притягиваются друг к другу, образуя внутреннюю комплексную соль нейтрального характера. Это препятствует взаимодействию щелочи (гидроксида натрия) с карбоксильными группами.
Для того чтобы высвободить карбоксильные группы моноаминодикарбоновых кислот белков, сделать их доступными для титрования щелочью, в молоко добавляют формальдегид (формалин), который, взаимодействуя с аминогруппами белков, блокирует их. При этом карбоксильные группы освобождаются и становятся доступными для титрования гидроксидом натрия.
При пастеризации и стерилизации молока под воздействием высокой температуры происходят сложные конформационные изменения белковых молекул. Термолабильные сывороточные белки денатурируют, взаимодействуют с κ-казеином, осаждаясь на поверхности мицелл казеина. Это приводит к увеличению размеров мицелл. Но в то же время низкомолекулярные соединения отщепляются от белков, в том числе коллоидного фосфата кальция, который является связующим звеном в виде фосфорнокальциевых мостиков между субмицеллами в мицелле казеина. Это приводит к распаду мицелл на более мелкие образования [3].
Кроме того, κ-казеин может терять гидрофильные гликомакропептиды, образующие защитный «волосяной покров» на поверхности мицелл. Вследствие этого мицеллы уменьшаются в размерах, а также теряют устойчивость и частично агрегируют [4]. Это явление иллюстрируют электронно-микроскопические фотографии сырого и пастеризованного молока. В данном случае при пастеризации молока в течение 30 с при 75 °С наблюдается образование агломератов из более мелких, чем в сыром молоке, частиц казеина.
Очевидно, что в зависимости от кислотности молока, температуры и продолжительности теплового воздействия будут преобладать те или иные изменения, внешне проявляющиеся в уменьшении или увеличении размеров мицелл. В результате этих преобразований существенно меняется количество доступных для титрования карбоксильных групп по сравнению с нативным состоянием белка в сыром свежем молоке, что отражается на результатах измерений массовой доли белка методом формольного титрования, полученные данные будут недостоверными.
После 10 мин выдержки при данной температуре существенно увеличиваются измеренные значения массовой доли белка. После 30 мин выдержки в пастеризованном молоке результат превысил значения, полученные для сырого молока, на 0,7 %. При этом метод Кьельдаля в течение всей выдержки показал стабильные результаты.
Таким образом, во избежание ошибок при определении массовой доли белка методом формольного титрования нельзя нарушать область его распространения, которая ограничивается только сырым молоком. При этом следует отметить, что метод формольного титрования можно применять для определения белка в нормализованных по жиру смесях, идущих на производство молочных продуктов, но только до их пастеризации.
Что касается кислотности сырого молока, которая должна быть не более 20 °Т, то это ограничение на использование метода формольного титрования также связано со структурными изменениями белка. Вместе с тем оно не противоречит требованиям ТР ТС 033/2013 «О безопасности молока и молочных продуктов», ГОСТ 31449–2013 «Молоко коровье сырое. Технические условия» и ГОСТ Р 52054–2003 «Молоко коровье сырое. Технические условия», в которых верхний предел значений титруемой кислотности сырого молока, принимаемого на переработку, равен 21 °Т включительно. С учетом установленных границ абсолютной погрешности (±1,9 °Т для индикаторного метода измерения и ±0,8 °Т для потенциометрического [2]) в сыром молоке, отвечающем требованиям указанных документов по показателю титруемой кислотности, можно определять массовую долю белка методом формольного титрования. Однако если все же в нарушение установленных требований предприятие приняло для переработки молоко с повышенной кислотностью, то рассчитывать на корректные результаты измерений массовой доли белка этим методом не следует.
К неточным результатам определения массовой доли белка методом формольного титрования могут привести также следующие причины:
Список литературы
Д-р техн. наук О.В.Лепилкина, И.Т.Смыков, И.В.Логинова, Г.Б.Бухарина
ВНИИ маслоделия и сыроделия – филиал ФГБНУ «Федеральный научный центр пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН, Углич
Методом формольного титрования можно определить содержание белка в молоке кислотностью не выше 0т
МОЛОКО И МОЛОЧНЫЕ ПРОДУКТЫ
Методы определения массовой доли белка
Milk and milk products. Method for determination of protein
Дата введения 2015-07-01
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт молочной промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ «ВНИМИ» Россельхозакадемии)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июля 2014 г. N 68-П)
За принятие проголосовали:
Краткое наименование страны по
МК (ИСО 3166) 004-97
Сокращенное наименование национального органа по стандартизации
Минэкономики Республики Армения
Госстандарт Республики Беларусь
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 25 сентября 2014 г. N 1221-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 25179-2014 введен в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.
6 ПЕРЕИЗДАНИЕ. Ноябрь 2019 г.
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на молоко и молочные продукты (молочное сырье, питьевое молоко, сухое молоко) и устанавливает методы определения массовой доли белка: формольного титрования и колориметрический.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3652 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия
ГОСТ 4172 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия
ГОСТ 4204 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4328 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 11773 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный. Технические условия
ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 25794.1 Реактивы. Методы приготовления титрованных растворов для кислотно-основного титрования
ГОСТ 26809 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
В Российской Федерации действует ГОСТ Р 55063-2012 «Сыры и сыры плавленые. Правила приемки, отбор проб и методы контроля», ГОСТ Р 55361-2012 «Жир молочный, масло и паста масляная из коровьего молока. Правила приемки, отбор проб и методы контроля».
ГОСТ 27752 Часы электронно-механические кварцевые настольные, настенные и часы-будильники. Общие технические условия
ГОСТ 28498 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29169 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29251 (ИСО 385-1-84) Посуда лабораторная стеклянная. Бюретки. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 34454 Продукция молочная. Определение массовой доли белка методом Кьельдаля
3 Отбор проб
3.2 Если определение не может быть проведено сразу после отбора проб, их хранят в холодильнике при температуре (4±2)°С не более суток.
4 Условия проведения измерений
При выполнении измерений в лаборатории следует соблюдать следующие условия:
Текст книги «Экспертиза молочного сырья»
Автор книги: Ирина Трубина
Жанр: Педагогика, Наука и Образование
Текущая страница: 3 (всего у книги 6 страниц) [доступный отрывок для чтения: 2 страниц]
4.4. Определение массовой доли белков 4 4
ГОСТ 23327-98 Молоко и молочные продукты. Метод измерения массовой доли общего азота по Кьельдалю и определение массовой доли белка. ГОСТ 25179-90 «Молоко. Методы определения белка»
Белки – высокомолекулярные органические соединения, построенные из аминокислот. К основным белкам молока относятся казеин, глобулин и альбумин. Содержание белков в коровьем молоке колеблется от 2,8 до 3,8 %, в среднем, оно составляет 3,2 %, в том числе казеина около 82 %, на долю сывороточных белков приходится 15-22 % от общего количества белков молока. Молочные белки имеют важное пищевое и технологическое значение, от количественного содержания белков зависит выход сыра, творога и других белковых продуктов. Для контроля содержания белков в молоке применяют следующие методы: – метод Кьельдаля. Метод основан на сжигании органических компонентов пробы молока в колбе Кьельдаля с серной кислотой. По количеству освобождающегося при этом азота в виде аммиака, определяемого титрованием, вычисляют содержание азотистых веществ.
– колориметрический метод. Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки, связывать кислые красители (амидо черный) вследствие образования нерастворимого комплекса. При этом интенсивность окраски раствора уменьшается обратно пропорционально количеству белка. После удаления осадка измеряют оптическую плотность раствора оставшегося красителя и по эмпирической формуле определяют массовую долю белка в молоке.
– метод формольного титрования. Метод основан на реакции щелочных аминогрупп белка с формалином, при этом образуется метиламиновая кислота и, соответственно, повышается титруемая кислотность молока, по приросту которой определяют массовую долю белка в молоке.
– рефрактометрический. Метод основан на установлении разности показателя преломления луча света, проходящего через молоко и выделенную из него (после осаждения казеина хлористым кальцием) сыворотку.
– расчетный. При выводе расчетной формулы для определения белка в молоке (Бм) исходили из постоянства соотношения между составными частями молока. Белок: лактоза: зола = 9: 13: 2.
Определение массовой доли белков в молоке колориметрическим методом
Методика может быть реализована на универсальных фотоколориметрах типа КФК (2М, 3М, 5М), СФ-16 со светофильтрами для выделения спектральной области 590-600 нм, а также приборах «Про-Милк МК-2» фирмы Foss-Electric (Дания) и «Про-о-Мат-Ш» фирмы Funke-Gerber (Германия).
Приготовление реактивов. Реактив 1 (буферный раствор). Взвешивают 31,7 г лимонной кислоты и 8,4 г (12-водного) или 3,4 г безводного ортофосфата натрия. Реактивы помещают в колбу и добавляют в нее 400 см 3 дистиллированной воды. Содержимое нагревают до температуры около 70 °C, перемешивают до полного растворения и охлаждают до 20 о С.
На фотоэлектроколориметре или спектрофотометре в кювете с длиной рабочей грани 10 мм при 590-600 нм измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к разбавленной надосадочной жидкости. Массовую долю белка (%) вычисляют по формуле (34.3):
где D – оптическая плотность;
7,78 и 1,34 – эмпирические коэффициенты.
Определение массовой доли белков методом формольного титрования
Метод применяют для контроля массовой доли белка в молоке кислотностью не более 22°Т. Консервирование проб молока не допускается.
Нейтрализация формалина. К 50 см 3 формалина добавляют 3-4 капли раствора фенолфталеина и затем по каплям приливают сначала 40 %-ный, а в завершение 0,1 н раствор гидроксида натрия до появления слабо-розового окрашивания.
Приготовление эталона окраски. В колбочку для титрования или химический стакан отмеривают 20 мл молока и добавляют 0,5 мл 2,5 %-ного сульфата кобальта.
Техника анализа. В химический стакан или колбу для титрования пипеткой отмеривают 20 см 3 молока и добавляют 0,25 см 3 (10-12 капель) раствора фенолфталеина, а затем оттитровывают 0,1 н раствором гидроксида натрия из бюретки до появления слабо-розовой окраски, соответствующей контрольному эталону. Затем вносят 4 см 3 нейтрализованного формалина, перемешивают круговыми движениями и через 1 мин вторично титруют до такой же окраски, как и при первом титровании.
Массовая доля (%) общего количества белков в молоке равна количеству 0,1 н раствора щелочи, израсходованного на титрование в присутствии формалина, умноженному на коэффициент 0,959 (4.4):
Определение массовой доли белков рефрактометрическим методом
Массовую долю белков в молоке данным методом определяют на рефрактометрах типа АМ и ИРФ-464.
Проведение анализа. В 3 флакона отмеривают по 5 см 3 молока и добавляют по 6 капель раствора хлорида кальция. Флаконы закрывают пробками и перемешивают содержимое. Флаконы помещают в водяную баню так, чтобы уровень воды достигал половины высоты флаконов, закрывают крышкой, доводят до кипения и кипятят не менее 10 мин. Не открывая бани, сливают воду через отверстия в крышке и наливают в баню холодную воду для охлаждения. Флаконы энергично встряхивают и разрушают белковый сгусток. После чего их помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 мин. Образовавшуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и наносят 1-2 капли на измерительную призму рефрактометра. Закрывают измерительную призму осветительной.
Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают окрашенность границы света и тени. Снимают показания оптической плотности сыворотки (Бс) по шкале «Белок» не менее 3 раз и вычисляют среднее арифметическое. Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают водой и вытирают фильтровальной бумагой. Помещают на измерительную призму 2 капли исследуемого молока и также снимают показания (не менее 3 раз) по шкале «Белок» – Бм. Массовую долю белка в молоке Б (%) вычисляют по формуле (4.5):
Б = Бм – Бс (4.5) где Бм и Бс – оптическая плотность молока и выделенной из него безбелковой сыворотки.
Определение массовой доли белков расчетным методом (приблизительно)
где Жм – массовая доля жира в молоке, %;
А – плотность молока, °А;
0,075, 0,098, 0,085 – эмпирические коэффициенты.
4.5. Рефрактометрический метод определения лактозы в молоке
Данным методом на рефрактометрах типа АМ-2, ИРФ, РЛ или РЛП возможно определение лактозы в молочной сыворотке.
Метод основан на способности безбелковой сыворотки, преломлять проходящий через нее свет в зависимости от концентрации лактозы.
Подготовка к анализу. Подготовка к анализу заключается в получении безбелковой сыворотки из исследуемого молока. В медицинский флакончик отмеривают 5 см 3 молока и добавляют 5 капель хлорида кальция. Флакончик закрывают пробкой и перемешивают. Затем для полного осаждения белков флаконы ставят в кипящую водяную баню (с завинченной крышкой) на 10 мин. После чего воду из бани сливают через отверстия в крышке и флаконы охлаждают под проточной водой. Затем стеклянной трубкой или пипеткой с ватным тампоном в нижней части отбирают немного сыворотки, фильтруя ее через вату.
Техника анализа на рефрактометрах типа АМ-2 или ИРФ. На измерительную призму рефрактометра наносят 1-2 капли прозрачной сыворотки. Закрывают измерительную призму осветительной. Наблюдая в окуляр рефрактометра, специальным корректором убирают расплывчатость и окрашенность на границе света и тени. Снимают показания по шкале «Белок» (Xi) Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают водой и вытирают фильтровальной бумагой.
Затем на призму наносят 1-2 капли дистиллированной воды и также снимают показания по шкале белок (Х2). Массовую долю лактозы (Л) в процентах находят по формуле (4.7):
где: Х1 – показание по шкале «Белок» для сыворотки, %;
Х2 – показание по шкале «Белок» для дистиллированной воды, %
Техника анализа на рефрактометре РЛ-2. Рефрактометр РЛ-2 имеет две шкалы: «показатель преломления» в пределах 1,33-1,54 и «содержание сухих веществ по сахарозе» до 95 %. Рефрактометр на «0» устанавливают при 20 °C. Перед работой камеры призм рефрактометра присоединяют штуцерами к ультратермостату и пропускают воду с температурой 17,5 °C в течение 1015 мин. Затем проверяют установку нуля. На нижнюю призму наносят 2 капли дистиллированной воды, закрывают верхней и устанавливают окуляр на резкость видимости по шкале и визирной линии (представляющей собой три штриха). Окуляр перемещают до совмещения визирной линии с границей светотени. Она должна совпадать с нулевым делением шкалы сухих веществ и с делением nD=1,333.
Призмы насухо вытирают и на поверхность нижней призмы наносят 2 капли прозрачной сыворотки. Наблюдая в окуляр, вращением рукоятки устанавливают поле зрения на фокус (ясную видимость), устраняют расплывчатость и радужность окраски границы светотени. Передвижением окуляра добиваются полного совпадения граничной линии с визирным указателем и отсчитывают показатель преломления сыворотки по левой шкале рефрактометра. Затем по таблице (Приложение Г) устанавливают массовую долю молочного сахара.
4.6. Определение механической загрязненности молока 5 5
ГОСТ 8218-89 «Молоко. Метод определения чистоты»
Метод основан на отделении механической примеси из дозированной пробы молока путем процеживания через фильтр и визуального сравнения наличия механической примеси на фильтре с образцом сравнения (эталоном).
Приборы и материалы. Приборы разных конструкций (типа «Рекорд» и др.) с диаметром фильтрующей поверхности 27-30 мм, ватные фильтры лабораторные, фланель (отбеленная).
Таблица 4.3 – Определение группы чистоты молока
6 Цвет фильтра должен соответствовать цвету молока в соответствии с требованиями стандарта. При изменении цвета фильтра молоко, независимо от количества имеющейся на фильтре механической примеси, относят к третьей группе чистоты.
4.7. Методы определения микробной обсемененности молока 6 6
ГОСТ Р 53430-2009 Молоко и продукты переработки молока. Методы микробиологического анализа. ГОСТ Р 52415-2005 «Молоко натуральное коровье – сырье. Люминесцентный метод определения количества мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов»
Пробы для микробиологических исследований отбирают в стерильную посуду с помощью специальных приспособлений с соблюдением правил асептики. Инвентарь для отбора проб перед использованием стерилизуют фламбированием (протирание ватой, смоченной спиртом, с последующим обжиганием на огне) или в автоклаве. Стерильные колбы с пробами закрывают стерильными пробками, горлышко посуды и пробку обертывают бумагой и обвязывают. Отобранные пробы следует исследовать не позднее 4 ч с момента взятия, при условии хранения или транспортирования при температуре не выше 6 °C.
Определение бактериальной обсемененности молока может быть проведено путем непосредственного посева молока на питательную среду (чашечный метод) или по редуктазной пробе.
Эта проба является косвенным показателем микробного загрязнения сырого молока. В процессе жизнедеятельности бактерии выделяют в окружающую среду наряду с другими окислительно-восстановительными ферментами анаэробные дегидразы, по старой классификации называемые редуктазами. Существует зависимость между количеством мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) в молоке и содержанием в нем редуктаз, что дает возможность использовать редуктазную пробу как косвенный показатель уровня бактериальной обсемененности сырого молока.
Метод основан на восстановлении резазурина окислительновосстановительными ферментами, выделяемыми в молоко микроорганизмами. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.
Определение микробной обсемененности молока редуктазными пробами
Основной раствор: 100 мг резазурина растворяют в 200 см 3 прокипяченной и охлажденной дистиллированной воды. Срок хранения не более 20 сут. при 3-5 °C.
Рабочий раствор готовят из основного разбавлением прокипяченной и охлажденной дистиллированной водой в соотношении 1: 10. Срок хранения не более 7 сут.
Техника анализа. Пробу с резазурином следует проводить не ранее чем через 2 ч после доения. В пробирки наливают по 1 см 3 рабочего раствора резазурина и по 10 см 3 исследуемого сырого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок.
Пробирки помещают в редуктазник с температурой воды (37 ±1) °С. Вода в редуктазнике или водяной бане после погружения пробирок с сырым молоком должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Температуру (37 ±1) °С поддерживают в течение всего времени определения. Пробирки с сырым молоком и резазурином на протяжении анализа должны быть защищены от света прямых солнечных лучей (редуктазник должен быть плотно закрыт крышкой).
Время погружения пробирок в редуктазник считают началом анализа. Показания снимают через 1 ч. Появление окрашивания молока в этих пробирках при встряхивании не учитывают.
По истечении 1 ч пробирки вынимают из редуктазника, осторожно переворачивают. Пробирки с молоком, имеющим окраску от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин. В зависимости от продолжительности обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из классов в соответствии с таблицей 4.4.
Таблица 4.4 – Определение бактериальной обсемененности и класса молока по редуктазной пробе с резазурином
Примечания: 1. Для оценки качества сырого молока при бактериальной обсемененности до 100 тыс. в 1 см 3 используют посев на чашки Петри.
2. При бактериальной обсемененности сырого молока до 300 тыс. время выдержки проб составляет 1,5 ч. Окраска сырого молока – от серо-сиреневой до сиреневой со слабым серым оттенком.
3. Цвет сырого молока от бледно-розового до белого через 1 ч выдержки свидетельствует о бактериальной обсемененности свыше 4 млн. жизнеспособных клеток.
Цветовая шкала для определения класса сырого молока по редуктазной пробе с резазурином представлена в приложении Д.
Определение микробной обсемененности молока биолюминесцентным методом
Метод основан на растворении соматических клеток, белка и жира молока АТФ-реагентом; фильтровании полученного образца через бактериальный мембранный фильтр; растворении отфильтрованных микроорганизмов реагентом на основе диметилсульфоксида; расчете концентрации АТФ микроорганизмов в полученном растворе по его биолюминесценции и определении количества микроорганизмов в 1 см 3 молока.
Для получения воспроизводимых результатов анализа молока необходимо соблюдать меры предосторожности, принятые при работе в микробиологической лаборатории, в частности: перед проведением анализа поверхность лабораторного стола обработать 70 % этанолом; использовать автоматические пипетки и стерильные наконечники к ним; для выполнения каждой операции использовать новый стерильный наконечник; после анализа каждого образца молока штативы для фильтравет, фланцевый наконечник шприца, пинцет и автоматические пипетки стерилизовать 70 % этанолом.
Подготовка реагентов к анализу. Во флакон № 1 внести 2 мл раствора из флакона № 2, выдержать 30 мин перед использованием. Полученный раствор АТФ-реагента можно хранить при комнатной температуре в течение рабочего дня, а при 4 °C – в течение 2-3 дней.
Во флакон № 3 внести 1 мл раствора из флакона № 4, перемешать. Полученный раствор АТФ контроля имеет концентрацию АТФ 10 пикомоль/мл. Полученный раствор следует использовать в течение одного рабочего дня.
Проверка АТФ-реагента по АТФ-контролю. Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра. Внести в нее 0,02 мл раствора АТФ-контроля из флакона №З и 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемешать, добавить 0,05 мл раствора АТФ-реагента из флакона № 1, быстро перемещать и измерить биолюминесцентный сигнал. Повторить измерения еще раз и найти среднее значение биолюминесцентного сигнала для АТФ-контроля (IK0HmpX Если измеренные значения различаются более, чем на 20 %, то необходимо провести третье измерение и усреднить два наиболее близких значения.
Техника анализа. Образец анализируемого молока объемом 50 мл довести до комнатной температуры и тщательно перемешать. Внести 1 мл молока во флакон № 5 с реагентом для предобработки молока и тщательно перемешать. Закрыть флакон, поместить его в водяную баню (45 ± 0,5) о С на 10 мин. Поместить в штатив для фильтравет с помощью пинцета фильтровальную полоску и установить на неё две фильтраветы.
Внести в одну фильтравету 0,2 мл предобработанного молока и продавить его на фильтровальную бумагу, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником. Сдвинуть фильтровальную полоску так, чтобы под фильтраветой оказался сухой участок полоски. Внести в ту же фильтравету две капли промывочного раствора из флакона № 6 и продавить его в фильтровальную полоску, создавая избыточное давление с помощью шприца с резиновым наконечником.
Поместить фильтравету с помощью пинцета в кюветное отделение люминометра и внести в нее 0,02 мл раствора из флакона № 4. Добавить через 1-2 мин в ту же фильтравету 0,05 мл раствора из флакона № 2, перемещать, затем добавить 0,05 мл АТФ-реагента из флакона № 1, быстро перемещать и измерить максимальный биолюминесцентный сигнал (IМ0Д).
Повторить операции со второй фильтраветой. Найти среднее значение биолюминесцентного сигнала для образца молока (IМ0Д). Если измеренные значения (I различаются более, чем на 20 %, то необходимо провести третье измерение и усреднить два наиболее близких значения.
Рассчитать концентрацию АТФ в молоке по формуле (4.8):
Определить величину КМАФАнМ по таблице 4.5, приведенной ниже.
Таблица 4.5 – Определение КМАФАнМ в сыром молоке биолюминесцентным методом
