что значит real time pcr

Что значит real time pcr

Исследование для выявления возбудителя гепатита C (HCV), в ходе которого с помощью метода полимеразной цепной реакции в реальном времени (РТ-ПЦР) определяется наличие генетического материала (РНК) вируса в крови.

Вирус гепатита С (ВГС), качественное определение РНК.

Синонимы английские

Hepatitis С Virus, RNA, Blood, HCV RNA, Real-Time PCR, Qualitative.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией в режиме реального времени.

Выявляет генотипы HCV: 1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 2i, 3, 4, 5a, 6.

Специфичность определения: 100 %.

Чувствительность определения: 50 МЕ/мл.

Линейный диапазон концентраций РНК вируса гепатита С, определяемых тест-системой: 150-1*10^8 МЕ/мл.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Общая информация об исследовании

Вирус гепатита С (HCV) – РНКсодержащий вирус из семейства Flaviviridae, который поражает печень. Он способен размножаться в клетках крови (нейтрофилах, моноцитах и макрофагах, В-лимфоцитах) и вызывать криоглобулинемию, болезнь Шегрена и В-клеточные лимфопролиферативные заболевания. HCV благодаря высокой мутационной активности может избегать воздействия защитных механизмов иммунной системы. Существует 6 генотипов и множество субтипов вируса, которые имеют разные значения для прогноза развития заболевания и эффективности противовирусной терапии.

Основной путь передачи инфекции – через кровь (препараты для переливания элементов крови и плазмы, донорские органы, нестерильные шприцы, иглы, инструменты для татуирования, пирсинга). Вероятно заражение при половом контакте и ребенка от матери во время родов, но это случается нечасто.

Острый вирусный гепатит, как правило, характеризуется бессимптомным течением и остается невыявленным в большинстве случаев. Только у 15 % инфицированных заболевание протекает остро – с тошнотой, ломотой в теле, отсутствием аппетита и потерей веса (редко сопровождается желтухой). У 60-85 % инфицированных развивается хроническая инфекция, что в 15 раз превышает частоту хронизации при гепатите В. Хронический вирусный гепатит С протекает с повышением печеночных ферментов и скудным проявлением симптомов. У 20-30 % больных заболевание приводит к циррозу печени, увеличивая риск развития печеночной недостаточности и гепатоцеллюлярной карциномы.

Выявление РНК HCV свидетельствует о размножении вируса в организме и помогает диагностировать заболевание. Генетический материал вируса можно обнаружить методом ПЦР через 10-12 дней после инфицирования – в этот период специфические антитела, которые образуются через несколько месяцев после заражения, отсутствуют и биохимические показатели функции печени находятся в пределах референсных значений. РНК вируса гепатита С с высокой специфичностью и чувствительностью определяют качественно или количественно. Благодаря качественному методу подтверждается факт инфицирования или гибели вируса. Это особенно важно в ранней диагностике вирусного гепатита у людей, подвергшихся риску заражения, а также при контроле за противовирусной терапией. При лечении альфа-интерфероном отсутствие РНК вируса через 24 недели после завершения терапии служит критерием ее эффективности.

Для чего используется исследование?

Когда назначается исследование?

Что означают результаты?

Референсные значения: не обнаружено.

Причины положительного результата

Причины отрицательного результата

Что может влиять на результат?

Причины ложноотрицательного результата:

Кто назначает исследование?

Источник

ПЦР для начинающих

Руководство по ПЦР в реальном времени для начинающих

Полимеразная цепная реакция, или ПЦР – это настоящий краеугольный камень современной молекулярной биологии. В наше время все большее распространение получает ее «продвинутая» версия под названием полимеразная цепная реакция в реальном времени (Real-time PCR), благодаря которой стало возможным раскрыть максимальный потенциал данной методики.

Чтобы понять суть Real-time PCR, необходимо имеет представление о том, какие процессы проходят в пробирке во время «обычной» ПЦР.

ПЦР представляет собой реакцию амплификации молекул ДНК. Рассмотрим два случая, когда в исследовательской практике возникает необходимость амплифицировать (то есть увеличить во много раз) количество ДНК в образце. Например, для судмедэксперта важно размножить небольшое количество ДНК, которая была найдена на месте преступления. Либо исследователю нужно сравнить два образца и узнать, в каком из них больше ДНК. Для такого рода анализа необходимо, чтобы в образце было достаточно ДНК для ее детекции. Если ДНК слишком мало, в сравниваемых образцах проводят ПЦР при одних и тех же условиях, и по количеству амплифицированного продукта определяется, в каком из образцов было больше ДНК изначально.

Главным веществом, благодаря которому происходит ПЦР, является термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза. Этот фермент синтезирует цепочку ДНК из свободных нуклеотидов, содержащихся в реакционной смеси (dNTPs), по принципу комплементарности. Матрицами для создания новых цепочек являются исследуемые молекулы ДНК. Важный момент – ДНК-полимераза «работает» на одноцепочечной ДНК, при этом «точка старта» для нее может быть только на двухцепочечной ДНК.

Именно эта особенность данного фермента позволяет амплифицировать только те фрагменты ДНК, которые интересны исследователю, а не весь геном организма сразу. Для этого в реакционную смесь добавляют небольшие фрагменты ДНК (олигонуклеотиды), называемые праймерами (англ. primer, то есть «первичные»). Они присоединяются (отжигаются) на матричную молекулу ДНК вокруг исследуемого гена, запуская работу полимеразы в нужном направлении.

Контроль ПЦР обеспечивается благодаря смене температуры образцов – за счет этого обеспечивается регуляция активности фермента и присоединения праймеров.

Для того, чтобы начать реакцию, температуру повышают до 95°C. При такой температуре двухцепочечная ДНК денатурирует до одноцепочечной.

Потом температуру понижают до

60°C. Это позволяет праймерам присоединиться вокруг исследуемого фрагмента.

Таким образом, у полимеразы появляется точка старта, от которой она может начинать синтез новой цепочки ДНК:

Оптимальная температура для работы ДНК-полимеразы составляет 72°C, поэтому на этом этапе цикла (он называется элонгацией) температура образца повышается до 72°C, для того, чтобы фермент работал с максимальной скоростью.

По окончанию цикла мы получаем в 2 раза больше ДНК, чем было в начале.

Такие температурные изменения повторяются по кругу в течение 40 «циклов». То есть, из одной копии ДНК получаются две, из двух – четыре, из четырех – восемь и так далее, пока их количество не будет исчисляться миллиардами.

После амплификации полученную ДНК можно разделить на агарозном геле и окрасить (визуализировать). Чем ярче будет полоса на геле, тем большее количество копий нужных нам генов получилось в результате реакции.

ПЦР в реальном времени (Real-time PCR)

Точно такие же принципы лежат в основе ПЦР в реальном времени. Но вместо того, чтобы оценивать продукты амплификации на геле после проведения реакции, за этим процессом можно наблюдать «онлайн». Обеспечивается это тем, что образец, помещенный в амплификатор, на протяжении всего процесса находится под наблюдением специальной камеры, которая называется детектором.

Существует множество технологий мониторинга процесса ампификации, но суть у них одна: при синтезе каждой новой копии ДНК возникает флуоресцентный сигнал, который улавливается детектором. Чем интенсивней флуоресценция, тем больше продуктов амплификации находится в образце.

ПЦР в реальном времени имеет множество преимуществ перед обычной ПЦР:

Зонд или SYBR® Green. Выбор правильной системы визуализации для вашего эксперимента.

Приступая к планированию ПЦР-анализа, важно определить систему визуализации продуктов реакции. В общем случае, существуют две системы: интеркалирующие красители (напр. SYBR® Green) и растворы, основанные на линейно разрушаемых зондах (напр. TaqMan®). В основе обоих систем состоит принцип генерирования флуоресцентных сигналов при синтезе новых копий ДНК и детекции этих сигналов прибором в режиме реального времени.

SYBR® Green (или любой другой интеркалирующий краситель)

SYBR® Green является наиболее используемым интеркалирующим красителем в современной практике. Кроме него существует множество других красителей подобного класса, но наверняка вы слышали именно о SYBR® Green. Принцип действия у них один: сам краситель имеет собственный флуоресцентный фон, но связываясь с двухцепочечной ДНК, он встраивается между ее цепочками. Это приводит к изменению конфигурации молекулы красителя, заставляя ее флуоресцировать горазда сильнее. Все просто – чем больше ДНК образуется в процессе ПЦР, тем сильнее происходит флуоресценция в образце.

Линейно разрушаемые зонды (по типу TaqMan®)

ДНК-зонды представляют собой меченые флуоресцентными красителями олигонуклеотиды (короткие фрагменты ДНК). Их нуклеотидная последовательность такова, что они гибридизируются на матричной молекуле ДНК рядом с праймером и дают флуоресцентный сигнал. 5’-конец зонда мечен репортерным флуоресцентным красителем. Чаще всего используется зеленый краситель FAM, но также могут использоваться VIC, ROX, CY5 и другие, которые флуоресцируют на другой длине волны, благодаря чему возможно проводить одновременный анализ по разным каналам детектора. На 3’-конце зонда располагается молекула гасителя – она обеспечивает подавление флуоресценции метки. Таким образом, когда репортерный краситель и его гаситель находятся на физически близком расстоянии друг от друга, общий уровень флуоресценции низкий.

В процессе ПЦР зонд прикрепляется к матричной молекуле ДНК сразу после праймера. Далее, зонд расщепляется полимеразой во время реакции. За счет этого молекула гасителя оказывается далеко от репортера, его флуоресценция возрастает, и так происходит на каждом цикле ПЦР.

Что нужно учитывать: стоимость

Оценка стоимости является неотъемлемой частью планирования исследований. Использование линейно разрушаемых зондов обходится дороже, чем интеркалирующих красителей. То есть, если вас интересует большое количество генов, интеркалирующий краситель будет наилучшим выбором. Если же у вас есть небольшой набор генов и вам надо сосредоточится исключительно на них, следует использовать зонды.

Что нужно учитывать: специфичность

Зонды: В общем случае, линейно разрушаемые зонды дают более точные результаты. Объясняется это их высокой специфичностью. Если вы получаете флуоресцентный сигнал от зонда, то можно быть уверенным, что он гибридизировался именно с целевым участком генома – гибридизация происходит исключительно в ограниченом праймерами пространстве. Благодаря этому нет необходимости проводить постамплификационных анализов для того, чтобы убедиться, что все прошло правильно.

Интеркалирующие красители: Слабым местом интеркалирующих красителей является то, что они неспецифичны. Если во время ПЦР поисходит амплификация не того участка ДНК, либо вовсе нескольких разных участков, вы все равно получаете кривую амплификации, которая идентична кривой при амплификации целевых генов. Интеркалирующие красители генерируют флуоресцентный сигнал при связывании с любой двухцепочечной ДНК, независимо от ее нуклеотидной последовательности. То есть, необходимо проводить дополнительные анализы, которые подтверждают наличие специфичных продуктов амплификации, например, оценку графика температуры плавления ампликонов. Подобные виды анализов требуют высокого уровня квалификации оператора, но только благодаря им можно рассчитывать на достоверность полученных данных.

Что нужно учитывать: количество ДНК-матрицы

Так как интеркалирующие красители обладают малой специфичностью, их эффективность при низкой концентрации ДНК в образце крайне мала. При таких условиях праймеры часто образуют между собой димеры или отжигаются на нецелевых участках ДНК. При этом образуется двухцепочечная ДНК и интрекалирующие красители все равно будут давать сигнал.

Можно взять за правило: если количество ДНК в ваших образцах малое (значение Cq>30), то использование интеркалирующих красителей будет сопряжено с трудностями и рекомендуется применять линейно разрушаемые зонды. Если ДНК много (значение Cq

Источник

Сколько стоит сдать ПЦР-анализ

Я пять лет работал в государственной медицинской лаборатории.

По опыту знаю, что пациентам бывает непросто разобраться с тем, какие тесты им нужно сдавать, да и нужно ли вообще. В этой статье расскажу, что такое ПЦР-анализы и можно ли на них сэкономить.

Сходите к врачу

Наши статьи написаны с любовью к доказательной медицине. Мы ссылаемся на авторитетные источники и ходим за комментариями к докторам с хорошей репутацией. Но помните: ответственность за ваше здоровье лежит на вас и на лечащем враче. Мы не выписываем рецептов, мы даем рекомендации. Полагаться на нашу точку зрения или нет — решать вам.

Что такое ПЦР-тесты и зачем их сдавать

В отличие от криминалистов, врачей обычно интересуют две вещи:

Но генетические анализы нужны не так уж часто, поэтому в статье мы будем говорить про ПЦР-анализы на инфекции.

Как работает ПЦР-анализ. У большинства живых существ на нашей планете, за исключением некоторых вирусов с РНК-геномами, генетический материал представляет собой длинную двухцепочечную молекулу ДНК.

Цепочка ДНК состоит из «звеньев» — нуклеотидов. Это четыре небольшие молекулы, строение которых универсально для всех живых существ. Из одного и того же набора нуклеотидов можно собрать геном вируса оспы, человека или синего кита. Вся разница — в порядке, в котором нуклеотиды идут в цепочке ДНК. Зная уникальный порядок нуклеотидов для участка ДНК какой-нибудь болезнетворной бактерии, мы можем засечь его присутствие в биологическом материале. А поскольку этот порядок уникален, мы не перепутаем его с человеческой ДНК.

Во время полимеразной цепной реакции кусочек чужеродного генетического материала из образца при помощи особого белка-фермента размножают много-много раз. В результате получается столько ДНК, что ее хватает для успешной идентификации.

Для каждого микроорганизма набор реактивов нужен свой. Поэтому врачи назначают не ПЦР-анализ вообще, а исследование на конкретный микроорганизм. Так что ПЦР-тест на гепатит С не поможет найти в образце еще и хламидии.

ПЦР-анализы бывают качественные и количественные. Качественные позволяют понять, есть ли в образце генетический материал бактерии или вируса, который мы ищем. А количественные — сколько именно там этого материала. Если сделать несколько таких тестов во время лечения, станет ясно, действует ли на микробов назначенное лекарство.

Как подготовиться к ПЦР-анализу

Чтобы выяснить, какая инфекция поразила человека, у него обычно берут кровь, мочу, образцы клеток слизистой из ротоглотки или с шейки матки.

В России кровь по умолчанию рекомендуется сдавать натощак, не менее чем с интервалом в 8—12 часов после приема пищи. Однако за рубежом таких строгих правил нет: считается, что перед походом в лабораторию можно позавтракать без сладкого и жирного, например кашей без сахара и масла, куриной грудкой или яйцом. Так что если у вас был легкий завтрак, кровь сдавать можно. Пить тоже не запрещено, но лучше ограничиться чистой водой без газа.

Если в качестве материала выступает моча, ее нужно собирать утром, как только проснетесь, в чистый контейнер для анализов или в вымытую с мылом банку из-под детского питания.

Правила, по которым нужно сдавать мазок на ПЦР из половых органов, отличаются для мужчин и для женщин. Всем за 1—2 дня до исследования нужно отказаться от секса, а в течение 1,5—2 часов перед исследованием — воздерживаться от мочеиспускания. Женщинам за сутки до процедуры не следует проводить спринцевание, пользоваться свечами и антисептиками для подмывания. Во время менструации сдавать биологический материал нельзя.

Можно ли верить ПЦР-тесту

Ни один лабораторный тест не обеспечивает абсолютной точности, всегда есть вероятность ошибки. Причем ошибиться тест может в обе стороны: либо не найти искомую инфекцию у пациента, которой он на самом деле заражен, либо обнаружить ее у человека, болеющего чем-то другим или вовсе здорового.

При этом ПЦР-анализы зачастую точнее других методов поиска возбудителя инфекционных заболеваний. Например, возбудителей гонореи у женщин можно искать под микроскопом, можно выращивать в чашке Петри, а можно определять методом ПЦР. В первом случае чувствительность анализа в пределах 36,2%, во втором — 89,7%, а в третьем — 89,9—100%. Получается, что ПЦР-анализ — самый надежный, и доверять ему можно. Примерно так же дела обстоят и с другими половыми инфекциями.

Информативность ПЦР в диагностике инфекций, передаваемых половым путемPDF, 152 КБ

Однако есть и относительно новые, менее надежные варианты ПЦР-тестов — например, на коронавирусную инфекцию. По словам Дениса Проценко, главного врача инфекционной больницы в Коммунарке, чувствительность тестов для выявления COVID-19 — 70—80%. Согласно китайским данным, чувствительность теста может быть еще ниже — в пределах 66—80%.

Но здесь многое зависит от времени взятия образца. Если мазок из горла взяли через 3—4 дня после появления симптомов, то вирус уже мог успеть спуститься из ротоглотки в легкие, и тогда вероятность найти его в мазке составляет всего 40%.

Хотя ПЦР-тесты на коронавирус работают хуже, чем ПЦР-тесты на половые инфекции, ничего точнее для диагностики коронавирусной болезни у нас пока нет. Врачи назначают повторный тест, если у них по результатам диагностики остаются сомнения.

Источник

PCR Как избежать ошибок?

Real-Time PCR: Как избежать ошибок

Ключевые факторы, оценка значения C_T, применение на практике

ПЦР в реальном времени (также известна как количественная ПЦР, real-time PCR, или qPCR) является простой и эффективной методикой количественного определения целевой последовательности ДНК в образцах. Зачастую, по причине крайней простоты освоения и выполнения данной методики, некоторые факторы, оказывающие критическое влияние на успешность метода, остаются без внимания. В этом обзоре мы рассмотрим ключевые факторы, которые необходимо учитывать при подготовке и интерпретации результатов real-time PCR.

Факторы, влияющие на C_T

C_T-величина (англ. Threshold cycle – пороговый цикл) – это значение количества циклов реакции, при котором кривая амплификации и прямая порога чувствительности прибора пересекаются (рис. 1B). Это значение является относительным показателем содержания ДНК-матрицы в образце, так как различия в количестве молекул матрицы в начале реакции влияют на количество циклов, необходимых для поднятия уровня флуоресценции выше уровня шума. Кроме того, на абсолютное значение C_T влияет множество других факторов, которые не зависят от изначального количества ДНК-матрицы в реакции. В данной статье мы обсудим самые часто встречаемые факторы, влияющие на значение C_T и выясним, как правильно оценивать эффективность прохождения real-time PCR.

На рисунке 1 изображены некоторые параметры кривой амплификации. Экспоненциальная фаза на рисунке 1B соответствует линейной фазе кривой на рисунке 1C. На рисунке 1C пороговое значение должно пересекать линейный участок кривой амплификации. Значение C_T обратно пропорционально количеству ДНК-матрицы в реакции, то есть чем меньшее количество ДНК-матрицы находится в реакционной смеси, тем большее количество циклов необходимо для достижения порогового количества продукта амплификации. Однако любые изменения в составе реакционной смеси или настройках детектора флуоресценции могут оказывать влияние на значение C_T. Соответственно, значение C_T для реакций, которые были проведены при разных условиях или в которых были использованы разные реактивы, не могут быть непосредственно сравнены друг с другом.

Рисунок 1

Рисунок 1: A: Значение Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции репортерного красителя к интенсивности флуоресценции референтного красителя. Другими словами, Rn – это репортерный сигнал, нормализованный к сигналу ROXÔ. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение Rn.

B: Значение ΔRn представляет собой разницу значений Rn и базовой линии. На этом рисунке ось X отображает номер цикла ПЦР, ось Y – значение ΔRn.

C: График кривой амплификации представлен в виде логарифмической функции Log(ΔRn) от номера цикла.

Влияние компонентов реакционной смеси

Интенсивность флуоресценции каждой молекулы зависит от внешних факторов, к ним относятся, например, pH или концентрации солей в реакционной смеси. На рисунке 2 изображён график флуоресценции зонда TaqMan® в двух различных реакционных смесях. Обратите внимание, что интенсивность флуоресценции в реакционной смеси A выше, несмотря на одинаковую концентрацию ДНК-матрицы, зонда и красителя ROX™ в обеих смесях.

Рисунок 2

Рисунок 2: Пики флуоресценции, полученные при анализе двух разных реакционных смесей с одинаковым количеством ROX™. Различия в значении сигналов обусловлено составом реакционных смесей. На этом рисунке ось X отображает длину волны флуоресценции, ось Y – интенсивность свечения флуорофора.

В результате, значение ΔRn будет различным, это отображено на рисунке 3. Обратите внимание, что базовые линии для двух реакционных смесей различны (рисунок 3А). Различие в значении C_T не отображает общую производительность реакционной системы (рисунок 3B). Реакционные смеси с эквивалентными показателями чувствительности могут иметь различные абсолютные значения C_T.

Рисунок 3.

На рисунке 3 в реакционных смесях A и B была проведена амплификация гена РНКазы P человека. В обеих образцах было использовано одинаковое количество геномной ДНК. На рисунке 3A показана зависимость Rn от номера цикла и базовые линии для обеих реакций. На рисунке 3B показана зависимость значения Log (ΔRn) от номера цикла. Значение порога чувствительности (зеленая прямая) одинаково для обеих реакций. Пороговый цикл C_T для реакционной смеси B (C_TB) наступает раньше, чем для реакционной смеси A (C_TA) при одинаковом количестве ДНК-матрицы в обеих образцах.

Пассивный референтный краситель ROX™

Величина Rn представляет собой отношение интенсивности флуоресценции красителя FAMÔ к флуоресценции красителя ROX. Таким образом, если концентрация красителя ROX будет меньше, а концентрация FAM останется неизменной, величина Rn будет выше. Это приведет к тому, что значение базовой линии станет выше, и вследствие этого, ΔRn будет меньше, что в конечном итоге приведет к другому значению C_T. Различие в значениях C_T при уменьшенных концентрациях ROX не является показателем увеличения чувствительности реакции, при этом могут появиться другие нежелательные последствия. Низкая концентрация ROX в реакционной смеси может привести к увеличению стандартного отклонения значения C_T, как показано на рисунке 4. Чем больше стандартное отклонение, тем менее достоверны данные, особенно если есть необходимость детектировать небольшие различия концентрации целевой последовательности ДНК. (Более подробно это описано в разделе Точность).

Рисунок 4.

На Рисунке 4. В трех реакционных смесях с различным содержанием ROX™ была проведена амплификация Трансформирующего ростового фактора бета (TGF beta). На рисунке 4A изображено значение C_T, на рисунке 4B изображено стандартное (среднеквадратическое) отклонение. Чем меньше концентрация ROX, тем раньше наступает пороговый цикл, но это увеличивает стандартное отклонение.

Эффективность ПЦР

Степень эффективности полимеразной цепной реакции тоже влияет на величину C_T. Сравнивая серии разведений, амплифицированых в условиях низкой и высокой эффективности реакции, мы обнаружим, что кривые амплификации имеют разный угол наклона. На рисунке 5, два образца (X и Y), амплифицированые в условиях низкой и высокой эффективности реакции, показывают различные значения C_T при одной и той же концентрации ДНК-матрицы. В этом примере, кривая амплификации при высокой эффективности реакции (синий график на рисунке 5) дает более низкое значение C_T при высокой концентрации ДНК-матрицы, хотя она имеет более высокую чувствительность при низкой концентрации ДНК-матрицы.

Рисунок 5.

Эффективность ПЦР зависит от типа анализа, качества реакционной смеси и качества ДНК в образце. Как правило, эффективность реакции 90-110% считается приемлемой.

Различие в значении C_T для двух образцов может достоверно свидетельствовать о различной концентрации ДНК-матрицы в этих образцах только при условии одинаковых настройках оборудования, реактивов и типа анализа. Однако, если анализ был проведен на разном оборудовании, были использованы разные реактивы, праймеры или зонды, либо реакции проводились в разных объемах – различия в значениях C_T не дадут нам достоверной информации. Следовательно, абсолютные значения C_T имеет смысл сравнивать только в том случае, если все условия реакции были абсолютно одинаковыми.

Как оценить эффективность ПЦР в реальном времени

В случае, если какие-либо условия эксперимента были изменены (например, анализ проводился на разном оборудовании или в разных реакционных смесях), необходимо учитывать следующие параметры.

Динамический диапазон

Рисунок 6.

На Рисунке 6 точный расчет эффективности реакции, сделанный на основе серии разведений ДНК-матрицы. Для двукратного разведения на 5 точках (оранжевый) потенциальный разброс значений выше, чем для десятикратного разведения на 5 точках (синий).

Значение R 2

Еще одним параметром, без которого невозможно точно рассчитать эффективность реакции, является коэффициент детерминации (R 2 ). В математической статистике этот параметр показывает, насколько точно мы можем спрогнозировать значение некой величины, зная другую. Если R 2 =1, тогда можно точно установить корреляцию величины X (количество ДНК-матрицы) к Y (значению C_T) (рисунок 7A). Если R 2 =0, тогда невозможно определить корреляцию величины X к величине Y (рисунок 7B). Значение R 2 >0,99, в целом, обеспечивает достаточную точность определения корреляции.

Рисунок 7.

На Рисунке 7 пример расчета R 2 для двух прямых. A: между x и y нет прямой корреляции. B: между x и y есть прямая корреляция.

Точность

Наиболее используемым способом расчета точности метода является вычисление стандартного отклонения (квадратный корень из вариансы). Если множество результатов имеют небольшой разброс относительно средней величины, тогда стандартное отклонение имеет малое значение, если же разброс велик, то стандартное отклонение больше.

На практике, большая выборка представляет собой распределение, близкое к нормальному. Это следствие центральной предельной теоремы, она гласит, что суммы многих независимых, одинаково распределенных случайных величин стремятся к нормальному распределению как к пределу. На рисунке 8А значения распределены таким образом, что 68% из них находятся в пределах одного стандартного отклонения, 95% – в пределах 2 стандартных отклонений, и 99,7% находится в пределах 3 стандартных отклонений.

Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (рисунок 8B). Для того чтобы определить количество ДНК-матрицы в диапазоне двукратных разведений в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,167. Чем больше стандартное отклонение, тем меньше вероятность достоверно найти разницу между образцами. Чтобы найти разницу между образцами в диапазоне двукратных разведений в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть ≤0,250 (рисунок 8C).

Рисунок 8.

На Рисунке 8 нормальное распределение и стандартное отклонение. На рисунке (A) показано нормальное распределение результатов анализа. Если эффективность ПЦР составляет 100%, то есть одно значение C_T, которое находится в пределах средних значений двукратного разведения (образцы X и Y). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 99,7% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 6 стандартных отклонений (1/6=0.167), как показано на рисунке (B). Для того, чтобы точно определить значение C_T для обоих образцов в 95% случаев, стандартное отклонение должно быть 1 C_T, деленное на 4 стандартных отклонений (1/4=0.25), как показано на рисунке (C).

Чувствительность

Любая из современных систем ПЦР в реальном времени достигла такого уровня чувствительности, что стало возможно детектировать единичную копию ДНК-матрицы в образце. Чувствительность не зависит от абсолютного значения C_T.

Как было сказано ранее, ключевым фактором для расчета чувствительности метода является эффективность реакции (рисунок 5). Другим важным моментом, связанным с детекцией малого количества копий ДНК является то, что распределение ДНК-матрицы будет отличаться от нормального. Вместо этого, оно будет стремиться к распределению Пуассона: то есть, если мы имеем большую выборку повторений, в каждом из которых, в среднем, по одной копии ДНК-матрицы, то, согласно распределению, в 37% образцов не будет ни одной копии, 37% будут иметь одну копию, а 18% – по две копии ДНК-матрицы (см. рисунок 9). Следовательно, для того, чтобы обеспечить достаточную достоверность детекции малого количества ДНК, необходимо проводить достаточное количество повторений, для того, чтобы обойти ограничения, связанные с распределением Пуассона.

Рисунок 9. Распределение Пуассона для малого количества копий ДНК-матрицы. Синяя кривая показывает распределение Пуассона для 3,3 пг ДНК (1 копия молекулы ДНК). Фиолетовая – распределение Пуассона для 6,6 пг ДНК (1 клетка, 2 копии молекулы ДНК).

Вывод

Вместе с тем, дополнительные виды контроля, такие как NTC (отрицательный контроль), no RT-контроль (контроль без обратной транскрипции) и контроль качества ДНК должны быть проведены для каждого анализа.

Источник