что значит протеолитическое действие

ПРОТЕОЛИТИ́ЧЕСКИЕ ФЕРМЕ́НТЫ

Том 27. Москва, 2015, стр. 625

Скопировать библиографическую ссылку:

ПРОТЕОЛИТИ́ЧЕСКИЕ ФЕРМЕ́НТЫ (про­теа­зы), груп­па фер­мен­тов клас­са гид­ро­лаз, ка­та­ли­зи­ру­ют внут­ри- и вне­кле­точ­ное рас­ще­п­ле­ние (про­те­о­лиз) пеп­тид­ных свя­зей C(O) ─ NH в бел­ках и пеп­ти­дах жи­вых ор­га­низ­мов. Вы­де­ля­ют две под­груп­пы П. ф.: эк­зо­пеп­ти­да­зы (пеп­ти­да­зы), от­ще­п­ля­ют ами­но­кис­ло­ты с амин­но­го ( ами­но­пеп­ти­да­зы ) или кар­бо­ксиль­но­го ( кар­бок­си­пеп­ти­да­зы ) кон­ца мо­ле­ку­лы бел­ка или пеп­ти­да; эн­до­пеп­ти­да­зы (про­теи­на­зы; этот тер­мин ино­гда ис­поль­зу­ет­ся так­же как си­но­ним тер­ми­на «П. ф.»), гид­ро­ли­зу­ют пре­им. внутр. пеп­тид­ные свя­зи. Боль­шин­ст­во изу­чен­ных П. ф. син­те­зи­ру­ют­ся в ви­де не­ак­тив­ных пред­ше­ст­вен­ни­ков – про­фер­мен­тов, или зи­мо­ге­нов. Их ак­ти­ва­ция про­ис­хо­дит пу­тём ог­ра­ни­чен­но­го про­тео­ли­за – из­би­ра­тель­но­го гид­ро­ли­за оп­ре­де­лён­ных пеп­тид­ных свя­зей, про­те­каю­ще­го ли­бо ав­то­ка­та­ли­ти­че­ски, ли­бо под дей­ст­ви­ем др. про­теи­наз, и обыч­но со­про­во­ж­да­ет­ся от­ще­п­ле­ни­ем пеп­ти­дов. П. ф. раз­но­об­раз­ны по фи­зи­ко-хи­мич. свой­ст­вам. В за­ви­си­мо­сти от ло­ка­ли­за­ции П. ф. про­те­о­лиз про­ис­хо­дит при разл. зна­че­ни­ях pH. Напр., пеп­син и га­ст­рик­си­ны же­луд­ка – при pH 1,5–2, фер­мен­ты ли­зо­сом – при pH 4–5, П. ф. сы­во­рот­ки кро­ви, тон­ко­го ки­шеч­ни­ка – при ней­траль­ных или сла­бо­ще­лоч­ных зна­че­ни­ях. Не­ко­то­рые П. ф. в ка­че­ст­ве ко­фак­то­ра ис­поль­зу­ют ио­ны ме­тал­лов (в т. ч. кол­ла­ге­на­за, тер­мо­ли­зин). П. ф. име­ют раз­ную суб­страт­ную спе­ци­фич­ность, ко­то­рая оп­ре­де­ля­ет­ся в осн. осо­бен­но­стя­ми бо­ко­вых групп ами­но­кис­лот. Так, напр., трип­син гид­ро­ли­зу­ет свя­зи, об­ра­зо­ван­ные кар­бок­силь­ной груп­пой осно́вных ами­но­кис­лот – ли­зи­на и ар­ги­ни­на, а эла­ста­за – ами­но­кис­лот с не­боль­ши­ми бо­ко­вы­ми це­пя­ми – ала­ни­на и се­ри­на. На рас­ще­п­ле­ние пеп­тид­ных свя­зей влия­ет так­же их дос­туп­ность при на­ли­чии про­стран­ст­вен­ной струк­ту­ры гид­ро­ли­зуе­мо­го суб­стра­та. Фер­мен­ты с уз­кой суб­страт­ной спе­ци­фич­но­стью (напр., кол­ла­ге­на­за, кал­лик­ре­ин) гид­ро­ли­зу­ют пеп­тид­ные свя­зи, об­ра­зо­ван­ные стро­го оп­ре­де­лён­ны­ми ами­но­кис­лот­ны­ми ос­тат­ка­ми, фер­мен­ты с ши­ро­кой суб­страт­ной спе­ци­фич­но­стью (в т. ч. пеп­син, па­па­ин) – свя­зи, об­ра­зо­ван­ные мно­ги­ми ами­но­кис­ло­та­ми. В плаз­ме кро­ви и др. био­ло­гич. жид­ко­стях, а так­же в раз­ных клет­ках и тка­нях при­сут­ст­ву­ют бел­ко­вые ин­ги­би­то­ры П. ф., ко­то­рые мо­гут бло­ки­ро­вать ак­тив­ность отд. фер­мен­тов или групп фер­мен­тов. Бла­го­да­ря им осу­ще­ст­в­ля­ет­ся ре­гу­ля­ция ак­тив­но­сти П. ф. в фи­зио­ло­гич. ус­ло­ви­ях, что пре­до­хра­ня­ет бел­ки от не­кон­тро­ли­руе­мо­го рас­ще­п­ле­ния.

Источник

Трофологический статус и панкреатические ферменты

Описаны методы оценки трофологического (нутритивного) статуса пациента, роль протеолитических ферментов поджелудочной железы для коррекции нутритивного статуса, показано, что препараты панкреатических ферменты должны использоваться в комплексных схемах те

Methods of evaluation of trophologic (alimentary) status of patient, the role of proteolytic enzymes of pancreas for correction of nutritive status are described. As it is shown pancreas enzymes preparations should be applied in complex therapy schemata for different pathologies.

Анализ трофологического (нутритивного) статуса пациента, являющийся необходимым компонентом оценки как здоровья, так и тяжести болезни, складывается из анализа широкого спектра данных, включая клинические и соматометрические. К первым относятся психомоторное развитие, психоэмоциональный статус (настроение), аппетит, состояние кожных покровов и подкожного жирового слоя, слизистых оболочек, мышечного тонуса и мн. др., включая особенности полового развития.

Соматометрические показатели включают массу тела, рост, окружность головы и плеча, толщину кожно-жировой складки над трицепсом, величину окружности мышц плеча и некоторые другие. Их нормальные значения лежат в пределах среднего квадратичного отклонения (M ± 1σ) или 25–75 перцентилей при использовании центильных таблиц.

Расчетные соматометрические индексы также широко используются в клинической практике. Наиболее известным из них является показатель отклонения массы тела (ПОМТ), выраженный в % и равный

ПОМТ = ФМТ (кг)/РМТ (кг) × 100%,

где ФМТ — фактическая масса тела, а РМТ — расчетная масса тела. Нормальными значениями ПОМТ принимаются 90–110%.

Индекс массы тела (ИМТ) (индекс Quetelet) рассчитывается как отношение ФМТ в кг к значению роста (в метрах), взятом в квадрате. Нормальные значения ИМТ представлены ниже:

Для оценки трофологического статуса используются также и специальные методы исследования, которые подразделяются на статические показатели и функциональные тесты. К последним относятся, в частности, определение аномальных метаболитов, активности ферментов, in vitro тесты, провокационные патофизиологические реакции.

Для оценки текущего питания могут быть использованы исследования кала (определение содержания минеральных веществ, липидов), мочи (витамины группы В, кроме В₁₂ и фолацина, витамин С, макро- и микроэлементы, включая Na, K, Ca, Mg, Se, аминокислоты и мн. др.), желчи (холестерин), крови (липиды, витамины, макро- и микроэлементы).

Оценка среднесрочного и долгосрочного питания может быть проведена при исследовании эритроцитов (витамины В₁, В₂, В₆, ниацин, фолацин, Se, Cu), лейкоцитов (витамин С, Zn), волос и ногтей (микроэлементы Zn, Cu и др.), жировой ткани (жирные кислоты) [1].

Маркерами белковой недостаточности являются показатели биохимического исследования крови. Определение уровня общего белка в крови и альбумина являются наиболее доступными из них, однако не самыми точными, что связано с относительно длительным периодом полураспада (в пределах 15–20 дней). Более точным является определение трансферрина (в норме: 2–4 г/л, Т1/2–8 дней) и транстиретина (в норме: 170–350 мг/л, Т1/2–2–3 дня).

По снижению белковых маркеров выделяют три степени белковой недостаточности: легкая — снижение показателей в пределах от 10% до 20%, средняя более 20% до 30%, тяжелая — более 30%.

Другими маркерами белковой недостаточности являются альфа1?кислый гликопротеин (орозомукоид), альфа1?

анти­трипсин, С-реактивный белок (СРБ). При этом признаками белковой недостаточности считается повышение указанных показателей на 5% и выше.

Также может рассчитываться прогностический индекс воспаления и состояния питания (ПИВСП), предложенный Carpeintier и Ingenbleek, который опирается на концентрацию сывороточного альбумина и транстиретина, а также на активность воспалительного процесса [2, 3]:

ПИВСП = альфа-1 КГП × СРБ × Альб × ТТР,

где альфа-1 КГП — концентрация альфа-1 кислого гликопротеина (мг/л), СРБ — С-реактивный белок (мг/л), Альб — уровень альбумина (г/л), ТТР — уровень транстиретина (мг/л) [4].

Показателями трофологического статуса также являются абсолютное число лимфоцитов, фактический расход энергии и многие другие.

Коррекция нутритивного статуса представляет собой многоплановый процесс, включающий, помимо устранения основного патологического процесса, также коррекцию питания, процессов переваривания и всасывания и метаболических процессов.

Адекватная функция пищеварительных желез, очевидно, необходима для нормального течения метаболических процессов в организме, включая рост и развитие. Секреция панкреатических ферментов, обеспечивающих основные процессы переваривания белков, жиров и углеводов, приведена в табл. 1.

К протеолитическим ферментам поджелудочной железы относятся трипсин, химотрипсин, эластаза и многие другие. Все протеолитические ферменты поджелудочной железы продуцируются в неактивном виде, и в дальнейшем происходит их активация трипсином. Сам трипсин также секретируется в виде неактивного трипсиногена, и его активация происходит в двенадцатиперстной кишке кишечной энтерокиназой. В свою очередь неактивная энтерокиназа активируется дуоденазой, также продуцируемой клетками двенадцатиперстной кишки.

Протеолитическое действие панкреатического секрета обуславливается тремя эндопептидазами — трипсином, химотрипсином и эластазой, которые расщепляют белки и полипептиды, поступающие из желудка. Трипсин специфически действует на пептидные связи, образуемые основными аминокислотами, химотрипсин — на связи между остатками незаряженных аминокислот, в то время как эластаза расщепляет связи, примыкающие к остаткам малых аминокислот, таких как глицин, аланин и серин. Активация трипсиногена осуществляется энтерокиназой, которая гидролизует его лизиновую пептидную связь. Образовавшийся трипсин действует как на новые молекулы трипсиногена, так и на химотрипсиноген, проэластазу и прокарбоксипептидазу — с высвобождением соответственно химотрипсина, эластазы и карбоксипептидазы.

К липолитическим ферментам относятся триацилглицероллипаза (панкреатическая липаза, расщепляющая триглицериды), фосфолипазы и некоторые другие. Кроме того, желчные кислоты активируют липазы, а также предварительно эмульгируют жиры, облегчая воздействие на них ферментов. Амилолитическая активность (расщепление крахмала) панкреатического секрета определяется амилазой, единственным панкреатическим ферментом, который секретируется сразу в активной форме.

Таким образом, экзокринная панкреатическая секреция обеспечивает основные процессы переваривания нутриентов, в связи с чем функциональное состояние поджелудочной железы в значительной степени определяет характер трофологического статуса больного. Так, в экспериментальных исследованиях было показано, что прибавка массы молодых животных достоверно коррелирует с экзокринной функцией поджелудочной железы [5, 6]. Аналогичные закономерности выявлены и в клинической практике, в связи с чем важной составляющей процесса коррекции нутритивного статуса является терапия препаратами панкреатических ферментов.

Высокоактивные препараты панкреатических ферментов (такие как Креон ® ), характеризуются высоким качеством субстрата, защитой от преждевременной активации в полости рта и пищеводе (капсула), определенным размером минимикросфер (1,0–1,2 мм), обеспечивающим равномерное перемешивание с желудочным и кишечным содержимым, а также защитой от инактивации в желудке (рН-чувствительная оболочка минимикросфер).

Высокоактивные препараты пищеварительных ферментов широко используются для лечения заболеваний, сопровождающихся экзокринной панкреатической недостаточностью, как абсолютной, так и относительной. Высокая эффективность их как трофологического фактора была показана впервые при лечении больных с муковисцидозом. Применение этих препаратов не только эффективно корригировало тяжелую панкреатическую недостаточность, характерную для данного заболевания, но и позволило изменить характер питания, повысить усвоение всех нутриентов, существенно улучшить нутритивный статус и, в итоге, не только увеличить продолжительность жизни больных, но и повысить ее качество.

Панкреатическая недостаточность по данным Научно-клинического отдела муковисцидоза ГУ МГНЦ РАМН (Москва) наблюдается у 95,3% пациентов с манифестацией в первые дни жизни. Следствием ее является нарушение всасывания жиров и белков. При этом до 50% поступившего белка может быть потеряно со стулом. У больных муковисцидозом обычно отмечается хорошее всасывание углеводов, однако метаболизм их может быть нарушен, вплоть до развития в старшем возрасте сахарного диабета [7].

Так, по данным Н. И. Капранова и соавт. после введения в терапию детей с муковисцидозом препарата Креон ® число госпитализаций уменьшилось примерно на 30%, также как и число курсов антибактериальной терапии, а качество и продолжительность жизни существенно повысились. Более того, в среднем суммарная стоимость лечения высокоактивными препаратами оказалась примерно в 2–3 раза ниже, по сравнению с применением препаратов средней степени активности, не говоря уже о более высокой фармакологической эффективности [8].

В работах Н. Ю. Каширской и соавт. было показано, что переход на диету без ограничения жиров у больных муковисцидозом возможен при условии адекватной заместительной терапии [7]. При этом достоверно меняется липидный спектр сыворотки крови. Высокожировая, высококалорийная диета в сочетании с приемом микросферических ферментов с рН-чувствительной оболочкой в состоянии поддерживать нормальный нутритивный статус и липидный состав плазмы крови больного муковисцидозом на нормальном уровне, что согласуется с данными зарубежных исследователей [9]. Кроме того, увеличение жирового состава пищи и применение новых форм панкреатических ферментов ведет к увеличению полиненасыщенных жирных кислот в составе фосфолипидов и их метаболитов. Последние работы в области повышения эффективности лечения больных муковисцидозом подтверждают и развивают эту концепцию [10].

Целиакия, наследственное заболевание, связанное с непереносимостью глютена, белка некоторых злаков, характеризуется синдромом мальабсорбции, при котором нарушеается кишечное всасывание практически всех нутриентов. Основой лечения целиакии является безглютеновая диета, которая дополняется посиндромной терапией, в т. ч. направленной на улучшение пищеварительных процессов в кишечнике. Практически обязательным компонентом этой терапии в последние годы стало применение высокоактивных препаратов панкреатических ферментов (Креон ® 10 000 или Креон ® 25 000).

По нашим данным, повышение экскреции триглицеридов с калом, указывающее на экзокринную недостаточность поджелудочной железы, наблюдается у 18% больных в активную стадию целиакии и у 52% — в стадию ремиссии. Механизм вовлечения поджелудочной железы в патологический процесс при целиакии, в первую очередь, связан с нарушением ее гуморальной регуляции со стороны кишечника на фоне атрофических изменений в слизистой оболочке, а также с неспецифическими метаболическими нарушениями у ребенка с тяжелой мальабсорбцией [11].

Исходя из этого, в план обследования больного целиакией должны входить ультразвуковое исследование поджелудочной железы, оценка ее экзокринной функции (оптимальным методом является определение эластазы-1 в кале, но могут быть использованы такие косвенные методы, как липидограмма кала), а также определение активности панкреатических ферментов в крови (трипсина, липазы или эластазы-1 в крови). В состав комплексной терапии целиакии должны входить препараты панкреатических ферментов (например, Креон ® ), назначение которых имеет патогенетическое значение. В большинстве случаев целесообразно использование препарата Креон ® 10000.

По данным ретроспективного анализа детей с целиакией в возрасте от 11 месяцев до 6 лет введение этих препаратов в состав терапии сокращает сроки купирования диарейного синдрома, а также интенсифицирует восстановление нутритивного статуса больных. Данные, касающиеся соматометрических показателей, а также динамики показателей белкового обмена, представлены в табл. 2 и 3).

Обращают внимание различия в итоговом значении ПОМТ через 2 месяца. В дальнейшем этот показатель, также как и другие, практически выравнивается. Эти изменения происходят на фоне нормализации стула — как его частоты, так и консистенции. Корреляция между частотой стула и ПОМТ — отрицательная сильная достоверная (r = 0,72; p ® 10 000)

Полученные данные указывают на большое значение состояния экзокринной секреции поджелудочной железы для восстановления трофологического статуса при целиакии, а также на необходимость назначения высокоактивных препаратов панкреатических ферментов с целью сокращения сроков восстановительного процесса.

Таким образом, панкреатические ферменты — важные трофологические факторы, которые обеспечивают восстановление трофологического статуса пациента при самой разнообразной патологии, а препараты панкреатических ферментов должны использоваться в комплексных схемах их коррекции.

Литература

С. В. Бельмер*, доктор медицинских наук, профессор
Е. В. Митина*
Н. А. Анастасевич*
Л. М. Карпина**
Н. С. Сметанина**, доктор медицинских наук, профессор

*ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н. И. Пирогова Минздравсоцразвития, **РДКБ, Москва

Источник

Когда желудку и кишечнику не хватает ферментов

Основным инструментом пищеварения являются ферменты, именно они выполняют всю основную работу. Логично, что при их недостатке процесс пищеварения нарушается, и организм начинает нам сообщать о проблемах, сигнализируя различными симптомами. Такие привычные всем симптомы как изжога, тяжесть в животе, боль, метеоризм, диарея или запор – являются прямым указанием на проблемы с пищеварением.

Ферменты поджелудочной железы – виды и функции

Пора узнать, что представляют собой ферменты, и как они влияют на пищеварение. Ферменты поджелудочной железы – это белковые комплексы или катализаторы, основной задачей которых является расщепление питательных веществ на простые, легкоусвояемые соединения. Таким образом, организм легко усваивает все необходимые элементы и витамины.

Какие ферменты вырабатывает поджелудочная железа и какие у них функции?

Особо интересно то, что организм может регулировать выработку тех или иных ферментов в зависимости от характера потребляемой пищи. То есть, если вы потребляете много хлебобулочных изделий, то упор в выработке будет сделан на амилазе, если потребляется жирная пища, то поджелудочная железа отправит в кишечник больше липазы.

Кажется, что работа полностью налажена, и сбоев быть не может. Но сбои случаются и достаточно часто: слишком тонкий механизм работы, который легко нарушить. Даже большой приём пищи с преобладанием жиров может сломать систему, и поджелудочная железа не сможет обеспечить нужное количество ферментов.

Появление проблем с пищеварением

Мы выяснили, что проблемы с пищеварением могут возникать из-за недостатка ферментов. Существует два основных механизма, при которых организму не хватает ферментов поджелудочной железы. В первом варианте проблема с выработкой ферментов кроется в самой поджелудочной железе, т.е. сам орган функционирует неправильно.

Во втором варианте нарушаются условия, при которых ферменты могут правильно работать. Подобное возможно в результате изменения кислотности среды кишечника, например, при воспалении или при изменении стандартной температуры окружения (36-37° С). Воспалительный процесс в кишечнике может возникать при различных состояниях: кишечные инфекции, аллергические реакции (пищевая аллергия, атопический дерматит).

Основные признаки нехватки ферментов поджелудочной железы

Выявить недостаток ферментов достаточно просто. Ключевыми симптомами являются тяжесть после еды, чувство распирания в животе и дискомфорт в животе. Нередко эти симптомы сопровождаются вздутием, урчанием, метеоризмом, диареей. Чаще всего такие симптомы могут возникать в рядовых ситуациях: при употреблении тяжелой, жирной пищи или при переедании, когда удержаться от множества вкусных блюд попросту не удалось. В этом случае не стоит бояться неполадок с поджелудочной железой или других заболеваний ЖКТ. Поджелудочная железа просто не справляется с большим объемом работы, и ей может потребоваться помощь.

Если нехватка ферментов и проблемы с пищеварением сохраняются длительное время, то это не остается незаметным для организма. Симптомы могут усугубляться и носить уже не эпизодический, а регулярный характер. Постоянная диарея дает старт авитаминозу, могут развиваться: белково-энергетическая недостаточность и обезвоживание во всем организме. Может наблюдаться значительное снижение массы тела. Помимо этого при тяжелых стадиях могут наблюдаться следующие симптомы недостатка ферментов поджелудочной железы 8 :

Поддержание пищеварения и лечение ферментной недостаточности

При проблемах с пищеварением могут помочь ферментные препараты (чаще они называются препаратами для улучшения пищеварения), основная задача которых компенсировать нехватку собственных ферментов в организме. Не зря такая терапия называется «ферментозаместительная». Критически важно, чтобы ферментный препарат максимально точно «имитировал» физиологический процесс.

На сегодняшний момент существуют различные препараты для улучшения пищеварения. Как же ориентироваться в многообразии средств и сделать правильный выбор?

Эффективный ферментный препарат должен соответствовать следующим критериям 5,6 :

Источник

Что значит протеолитическое действие

Одной из основных задач Национальной программы «Здоровье» основателем которого является Президент Туркменистана Гурбангулы Беодымухамедов – обеспечение населения страны лекарственными препаратами за счет лекарств отечественного производства,изучение возможности выращивания ценных лекарственных растений в условиях Туркменистана, разработка агротехники возделывания и обеспечение страны медицинскими препаратами и ценным сырьем для промышленности [1].

В современном мире большое внимание уделяется использованию в медицинской практике биологически активных препаратов растительного происхождения.

Мировая медицина ограничиваются от использования антибиотиков, так как снижается иммунная система и приводит к другим сложным последствиям. Ученые полагают, что в будущем антибиотики могут быть заменены супер-антителами, для которых не будет препятствием клеточная стенка, которые смогут проникать внутрь клеток и уничтожать болезнетворные бактерии, вирусы и токсины. Они испытывают технологию модификации антител, которая позволяет им свободно проникать в клетки и покидать их [1, 2–9, 12].

Авторы осознают, что при написании статьи не все задуманное удалось реализовать в полном объеме. Прекрасно понимают, что делают научный обзор по использованию лекарственных энзимов растительного происхождения в широком направлений, поэтому имеется недостатки как в теоретическом плане, так в прикладной, практической части. Но тем не мене вопрос использования нанотехнологии в генной инженерий и, прежде всего расшифровка геном человека позволяют создавать новые лекарственные препараты. Если будем лучше понимать роль генов в развитии болезней и то, как протекают процессы в наших клетках на наноуровне, сможем более целенаправленно вести исследования. С помощью генетики и биотехнологии сможем в будущем более эффективно выявлять причины заболеваний; тем самым исследования в области фармакология – это существенный шаг будет в деле создания инновационных лекарственных средств, устраняющих саму почину болезни. Большой интерес в этом предоставляют протеолитические ферменты растительного происхождения дынного древа [1–4].

Сделанный научно-информационый обзор, собранные материалы и методика подхода могут быть полезны для применения их не только в клинической медицине Туркменистана, но и в других странах мира.

Биотехнологические особенности дынного дерева

Лекарственное сырье. В качестве лекарственного сырья используют высушенный млечный сок – латекс. Коагулированные комья латекса крошат и высушивают на солнце или при легком искусственном подогревании (в последнем случае получают папаин более высокого качества). Полученный латекс растворяют в воде и осаждают спиртом для очистки папаина. В меньших количествах папаин содержится и в других частях растения, в частности в листьях (Folia Caricae Papayae) [2–4, 8–11].

Биологически активные вещества. Методом электрофореза в кислой среде в латексе Carica papaya L. идентифицировано 7 белков: липаза, хитиназа, лизоцим и комплекс протеолитических ферментов:

Папаин (EC 3.4.22.2) – монотиоловая цистеиновая эндопротеаза. По характеру ферментативного действия ее называют «растительным пепсином». Но, в отличие от пепсина, папаин активен не только в кислых, но и в нейтральных и щелочных средах (диапазон рН 3–12, оптимум рН 5) [2–4, 8–11, 17–20].

Химопапаин (EC 3.4.22.6) – монотиоловая цистеиновая протеиназа. Благодаря субстратной специфичности похожа на папаин, но отличается от него электрофоретической подвижностью, стойкостью и растворимостью [2–4, 12, 13].

Протеиназа IV – цистеиновая протеиназа, основная протеиназа латекса, составляет около 30 % присутствующего в нем белка (Buttle D. J. etc., 1989).Проявляет высокую степень гомологии с протеиназой III папайи (81 %), химопапаином (70 %) и папаином (67 %). Очень близка к химопапаину по молекулярной массе и заряду молекулы. Загрязнение этим ферментом химопапаина является причиной его гетерогенности в ходе исследований. M.P. Thomas и соавт. (1994) относят этот фермент к фракции химопапаина М [2–4, 8–11, 15, 16].

Карикаин (EC 3.4.22.30) – наиболее щелочная среди цистеиновых протеиназ латекса папайи. Подобно папаину, он сначала продуцируется в форме неактивного зимогена прокарикаина, содержащего ингибиторный прорегион из 106 N-терминальных аминокислот. Активация фермента заключается в отщеплении прорегиона молекулы без ее последующих конформационных изменений. Строение протеиназ папайи изучено с помощью рентгенструктурного анализа (Maes D. etc., 1996) [2–4, 11–18].

Протеиназа w (эндопептидаза А, пептидаза А) – монотиоловая цистеиновая протеиназа. Это полипептид, содержащий 216 аминокислотных остатков и 3 дисульфидные связи. Для проявления его ферментативной активности важно наличие свободного остатка цистеина в активном центре (Dubois T. etc., 1988). Проявляет высокую степень гомологии с папаином (68,5 %). По специфичности ферментативного действия напоминает папаин, поскольку связывается с субстратом в участках локализации дисульфидных связей. Расщепление происходит тогда, когда в следующей позиции находятся лейцин, валин или треонин. Пептидаза ІІ – щелочная монотиоловая цистеиновая протеиназа. В каталитическом центре содержит дитиоацильную группу.

В латексе неспелых плодов папайи содержатся также ингибиторы протеолитических ферментов: цистатин (ингибитор протеиназ с молекулярной массой 11 262 Да) и белок со свойствами ингибитора цистеиновых протеиназ, молекула которого состоит из 184 аминокислотных остатков, содержит 2 дисульфидные связи и 2 углеводных остатка в позициях Asp84 и Asp90 (Odani S. etc., 1996) [2–4, 12–19].

В спелых плодах дынного дерева содержится 8–12 % сахара, значительное количество витаминов А, В1, В2, С и D, тонизирующие вещества. В листьях папайи выявлены свободные и связанные фенольные соединения, танины, органические кислоты и алкалоиды.

В листьях имеются свободные и связанные фенольные соединения, танины, органические кислоты, стероидные и тритерпеновые сапонины, флавониды, липиды, кумарины, глюкозы, альколоиды, применяемые при лечении туберкулеза и обладающие желче- и мочегонными свойствами [2–4, 11–20].

Фармакологические свойства. Эти протеолитические ферменты растительного происхождения обладают противовоспалительными, антикоголяционными, диградрационными, болеутоляющими, бактерицидными, гемолитивными свойствами. Данные ферменты широко применяются в медицинской практике: офтомологии, хирургии, нейрохирургии, ортопедии, урологии, гастроэнтрологии и др. Они способствуют разрушать белки полупепдидов и аминокислот, растворяют мертвые клетки, при этом не влияя на нормальные.

Модификация комплекса протеиназ папайи синтетическими полимерами. Изучение деструкции ферментных препаратов

Проблема повышения эффективности терапии во многом решается благодаря поиску новых лекарственных средств, важное место среди которых отводится модифицированным производным биокатализаторов с пролонгированным терапевтическим действием [6–8]. Как правило, модификацию ферментов выполняют с использованием растворимых полимеров. В Институте молекулярной биологии и биологической физики АН Грузинской ССР получены водорастворимые и биосовместимые производные полиуретанов и полиамидов [6]. Ранее уже была показана их пригодность для использования в качестве стабилизирующих фермент (трипсин, химотрипсин) носителей [12]. В настоящей работе изучена модификация этими полимерами терапевтически значимого ферментного препарата – комплекса протеиназ папайи [12, 13].

С целью определения целесообразности дальнейшего медико-биологического испытания модифицированных ферментов проведено сравнительное изучение их деструкции под действием экстремальных рН и протеаз. Сопоставление данных о целостности набора молекул ферментного препарата (на основе результатов молекулярно-массового распределения и его каталитической активности) позволяет не только оценить влияние носителя на лекарственный агент, но и сформулировать рекомендации для фармакологического исследования модифицированных препаратов биокатализаторов.

В своей научной статье А.В. Максименко, Л.А. Надирашвили, В.В. Абрамова, Г.С. Еркомаишвили, Р.Д. Кацарава, В.П. Торчилин «Модификация комплекса протеиназ папайи синтетическими полимерами. Изучение деструкции ферментных препаратов» проведённых в Институт экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического научного центра АМН СССР и Институт фармакохимии имени И.Р. Кутателадзе АН Грузинской ССР, Тбилиси.

В статье авторами описана химическая модификация комплекса протеиназ папайи синтетическими полимерами – полиамидом, полиуретаном. Изучены свойства модифицированных ферментных препаратов: показана их устойчивость к протеолизу при физиологических условиях и деструкция в щелочной области рН. Модификация комплекса протеиназ папайи усиливает влияние цистеина на стабильность модифицированных препаратов. Осаждение их при кислых значениях рН позволяет легко отделять биокатализатор от реакционной смеси. Обсуждаются перспективы дальнейшего исследования полученных производных.

Условия проведения эксперимента

Реагенты. Нативный препарат комплекса протеиназ папайи (КПЛ) из млечного сока дынного дерева был выделен и охарактеризован по описанному методу [6, 7]. Полимерные носители были получены из Института физиологии им. И.С. Бериташвили АН Грузинской ССР. Ими были водорастворимый полиамид с молекулярной массой 50–60 кД.

(1)

и полиуретан с молекулярной массой 45–50 кД [4]

(2)

Этиловый эфир N-бензол-L-аргинина (ВАЕЕ), L-цистеин, «субтилизин Карлсберг» произведены фирмой Sigma (США). Проназа Е, N-этил-3-(3-диметиламинопропил) карбодиимид, 3-меркапто-1,2-пропандиол – производства фирмы Serva (ФРГ); сефадексG-75 superfine получен от фирмы Pharmacia (Швеция). Все остальные реагенты – продукты производства «Реахим» (СССР) аналитической степени чистоты.

Ковалентное присоединение КПЛ к полимерным носителям. Связывание ферментного препарата с карбоксилсодержащими полимерами проводили через карбодиимидную активацию в соответствии с [8]. 20 мг носителя (полиамида или полиуретана) растворяли в 2 мл 0,01 М раствора трис-буфера, рН 8,0. Затем добавляли 1 мл того же буферного раствора, содержащего 2,5 мг карбодиимида. Смесь инкубировали в течение 30 мин при 4°, после чего добавляли 1 мл раствора того же буфера, содержащего 10 мг нативного КПЛ и 2,5 мг цистеина (для сравнения были выполнены эксперименты и без цистеина в реакционной смеси). Дальнейшую инкубацию проводили в течение 20 ч при 4°. Препараты выделяли методом ультрафильтрации на установке «Amicon» (США) с фильтром ХМ-30, проводя отмывку дистиллированной водой до постоянной оптической плотности промывных вод (220 нм). После этого препараты лиофилизовали. Сравнительное определение молекулярной массы производных проводили методами гель-хроматографии и электрофореза.

Изучение деструкции ферментных препаратов. За деструкцией полимерных образцов cледили, сопоставляя профили элюции проб инкубационной смеси с колонки сефадекса G-75 [9]. Инкубацию препаратов проводили в 0,1 М трис-буфере, рН 7,4 и 0,1 М боратном буфере, рН 9,6, при 30° как в отсутствие, так и в присутствии протеаз – проназы или субтилизина. Концентрация в инкубационной смеси нативного препарата 1 мг/мл, модифицированных – 1–3 мг/мл; проназы 0,2 мг/мл, субтилизина 0,1 мг/мл; носителей (1 мг/мл). Оптическую плотность проб элюата для нативного и модифицированных препаратов регистрировали при 280 нм, для полимерных носителей – при 208 нм.

Определение каталитической активности. Каталитическую активность ферментных препаратов определяли методом измерения начальных скоростей гидролиза 0,05 М раствора ВАЕЕ с 0,1 М КС1 на рН-стате «Radiometer» (Дания) при рН 7,0 и комнатной температуре.

Влияние сульфгидрильных реагентов на каталитическую активность ферментных препаратов исследовали измерением последней до и после (в течение 5 ч) добавления 10 мг/мл меркапто-пропандиола (1 мМ) к растворам биокатализаторов [6].

Измерение термостабильности ферментных препаратов. Растворы нативного и модифицированного полиамидом или полиуретаном (10 мг/мл) комплекса протеиназ папайи инкубировали при 37 °С в 0,1 М буферных растворах, рН 7,4 или рН 9,6, в присутствии 6 мг/мл и в отсутствие цистеина. Периодически отбирали пробы из инкубационной смеси (0,2 мл) и определяли на рН-стате их каталитическую активность, как описано выше.

Титрование сульфгидрильных групп ферментных препаратов. Эксперимент проводили по методу Эллмана [10], как описано ранее [7]. Титрант – 5,5-дитио-бис-2-нитробензойная кислота (получен от фирмы Calbiochem, США), коэффициент экстинкции 13 600 М•см–1 [6, 7, 12. 13].

В результате получены:

Свойства препаратов комплекса протеиназ папайи, модифицированного синтетическими полимерами. В результате ковалентного присоединения КПЛ к полиамиду или полиуретану с носителем связывается около 90 % исходного количества белка (как в присутствии, так и в отсутствие цистеина в инкубационной смеси). Однако проведение модификации в присутствии цистеина обеспечивает получение препаратов с большей величиной остаточной каталитической активности, чем без этой аминокислоты. Так, для препаратов КПЛ-полиамид, полученных с цистеином и без него, остаточная каталитическая активность составляет 70 и 50 %, соответственно, а для КПЛ-поли- уретан – 70 и 20 %. Данные титрования сульфгидрильных групп в ферментных препаратах показывают, что, по-видимому, ковалентного присоединения цистеина к полимерной матрице не происходит (табл. 1). Цистеин способствует только реактивации обратимо инактивированных ферментов [6], повышая, как уже говорилось, остаточную каталитическую активность модифицированных препаратов.

Каталитические параметры – ферментативного гидролиза ВАЕЕ нативным и модифицированным комплексами протеиназ папайи (0,1 М KCI, рН 7,0, комнатная температура)

Источник